Individuazione e caratterizzazione di geni per metallotioneine e altre proteine detossificanti in ascidie

Lo scopo di questa ricerca è quello di analizzare le metallotioneine (MT) nei Tunicati, taxon il sister-group dei Vertebrati, allo scopo di studiare l’evoluzione delle metallotioneine nei deuterostomi invertebrati. Ho quindi isolato sequenze complete di cDNA per MT nei Tunicati Ciona intestinalis, Molgula manhattensis e Ascidiella aspersa. In questi organismi le MT presentano sequenze aminoacidiche dedotte simili, di lunghezza compresa tra 39 e 41 aminoacidi e con circa il 30% di residui cisteinici organizzati nei tipici cluster conservati delle MT dei Vertebrati. La mia indagine si è quindi concentrata su C. intestinalis, organismo modello dei Tunicati per il quale è disponibile la sequenza dell’intero genoma. Nonostante questo, nessuna MT era stata annotata. Dopo aver identificato la MT, la ricerca si è orientata su due percorsi. Il primo percorso era volto a comprendere quali fossero i tessuti coinvolti nella trascrizione di questo gene e quali ne fossero i profili di espressione in risposta a metalli pesanti quali Zn, Cd e Cu. In quest’ambito ho anche considerato la fitochelatino sitetasi (PCS), la Cu/Zn superossido dismutasi (Cu-Zn SOD), la glutammato cistein-ligasi (GCLC) subunità catalitica, la glutatione sintetasi (GS), la glutatione perossidasi 7 (GPX7) e l’antigene nucleare di proliferazione cellulare (PCNA), al fine di valutarne le relazioni. Il secondo approccio, di tipo bioinformatico, era volto a chiarire l’organizzazione genica, la struttura delle regioni promotrici e le identità di sequenza delle metallotioneine e delle altre proteine studiate, al fine di far luce sulla possibile evoluzione delle sequenze prese in esame. Le sequenza proteica dedotta da C. intestinalis (CiMT-1) è decisamente diversa dalle MT degli altri deuterostomi: essa risulta essere la più corta MT fino ad ora individuata in questo gruppo, presentando 39 aminoacidi contro 61-68 degli altri taxa. Inoltre, manca completamente il motivo KKS che connette i due domini (alpha e beta) delle MT dei vertebrati. Si evidenziano quindi bassi livelli di identità aminoacidica, tra 18,8% e 38,3%, con le MT degli altri deuterostomi. Tutte le MT dei vertebrati hanno struttura genica tripartita, con tre esoni e due introni. Gli introni differiscono in lunghezza, ma la loro posizione relativa è conservata: il primo introne interrompe la sequenza all’aminoacido 9, mentre il secondo introne interrompe la sequenza all’aminoacido 31 o 32, alla giunzione dei domini alpha e beta. CiMT-1 mostra la stessa struttura tripartita, con il primo introne nella posizione tipica dei vertebrati, mentre il secondo introne è posto nella regione 3‘UTR, come nelle MT degli echinodermi. Anche la regione promotrice di CiMT-1mostra caratteristiche presenti sia negli echinodermi che nei vertebrati: possiede tre half-ARE (antioxidant responsive element) come negli echinodermi ed una sequenza ARE tipica dei vertebrati. Esso presenta inoltre quattro MRE (metal responsive elements) ben distanziati. Il trattamento con Cd induce aumenti del trascritto di CiMT-1 con andamento irregolare: un primo aumento è presente a 6 h, seguito da una diminuzione fino a quasi i livelli di controllo a 24 h per poi ricrescere fino ad un picco massimo dopo 96 h. I trattamenti con Zn e Cu, invece, inducono valori di trascrizione quattro volte superiori rispetto ai livelli dei controlli solo a fine trattamento (120 h) con un andamento di crescita pressoché lineare nel tempo. Il trascritto per CiMT-1 è presente a livello dei soli granulociti. Tali cellule a 24 h di trattamento con Cd si accumulano nella tunica in numero circa doppio rispetto ai controlli. Pertanto la diminuzione di trascritto riscontrato a 24 h può essere conseguenza di questa migrazione cellulare, mentre il successivo aumento è presumibilmente da imputare a proliferazione cellulare specifica dei granulociti in circolo. Questo scenario è confermato dall’alto tasso di morte cellulare nella tunica, dove gli emociti si accumulano, ed inoltre dalla massiccia trascrizione di PCNA nei campioni trattati. Infatti sia CiMT-1 che PCNA presentano un picco di espressione a 96 h.. A confermare tale ipotesi sono i risultati relativi alla fitochelatino-sintetasi. In C. intestinalis il gene viene espresso dai granulociti ed i livelli di trascritto rimangono simili a quelli dicontrollo fino a 72 h, per poi crescere a 96 h. Da dati di letteratura è noto che questo gene non è inducibile, ma viene attivato in presenza di ioni metallici bivalenti. E’ molto probabile quindi, che questo picco non sia una conseguenza di un fenomeno di induzione, ma della forte proliferazione cellulare dei granulociti. E’ da notare che questo è il primo dato che dimostra la trascrizione di questo gene in organismi deuterostomi, la sua localizzazione esclusiva a livello dei granulociti e il suo coinvolgimento in processi di detossificazione da metalli. Lo studio degli andamenti degli altri geni coinvolti nella detossificazione suggerisce che la componente enzimatica (SOD, GPX) possa avere un ruolo marginale, mentre la componente tiolica (PCS, GS, GCL) svolga un ruolo primario in presenza sia di Cd, che di Cu e Zn. Inoltre la localizzazione tramite ibridazione in situ di questi trascritti evidenzia che gli emociti circolanti sono le cellule maggiormente coinvolte nei processi di detossificazione.