Advanced EPR spectroscopy provides new insight into triplet-triplet energy transfer in photosynthesis

I caroteni sono assi portanti del processo fotosintetico. A queste molecole sono affidati molteplici ruoli: condividono con le clorofille la funzione di raccolta dell’energia luminosa, stabilizzano i complessi proteina-pigmento e sono responsabili della protezione dell’intero apparato fotosintetico contro l’azione ossidante dell’ossigeno di singoletto. La funzione strutturale è stata studiata mediante diverse tecniche biochimiche in molteplici organismi: è stato dimostrato che i carotenoidi sono essenziali per la stabilità strutturale dei complessi proteici. Senza carotenoidi i complessi antenna non sono in grado di assemblarsi e la loro rimozione selettiva da proteine intatte ne causa la denaturazione. La funzione di raccolta della luce è stata estensivamente studiata tramite spettroscopie ottiche. La foto-fisica degli stati di singoletto nei caroteni è molto complessa e caratterizzata dalla presenza di transizioni proibite, dalla dinamica veloce tra stati eccitati e dalla bassa resa di fluorescenza. Anche i cammini di trasferimento di energia di singoletto tra caroteni e clorofille, importanti per la funzione di raccolta della luce, sono stati ampiamente caratterizzati. Molto meno è stato fatto riguardo al ruolo fotoprotettivo che rende i carotenoidi essenziali per gli organismi fotosintetici. I carotenoidi sono implicati nella fotoprotezione in moti modi e in diversi gradi in relazione alla durata e all’intensità delle condizioni di stress. Quando l’intensità della luce solare aumenta improvvisamente il primo meccanismo di fotoprotezione attivato è il trasferimento di energia tripletto-tripletto dalle molecole di clorofilla verso le molecole di carotenoide: questo trasferimento di energia previene la formazione di specie all’ossigeno altamente ossidanti che potrebbero essere prodotte dalla clorofilla in stato di tripletto. Lo stato di tripletto di carotenoide è quindi fisiologicamente importante. A differenza dei centri di reazione fotosintetici, che condividono tutti un’architettura strutturale molto simile, i complessi antenna esibiscono una più spiccata variabilità dovuta ai differenti adattamenti ambientali. Questa eterogeneità ha stimolato un’indagine comparativa al fine di evidenziare le caratteristiche fondamentali comuni o particolari adottate dai diversi organismi per rendere il trasferimento di energia di tripletto efficiente. Questa tesi rappresenta uno dei pochi studi dettagliati completamente focalizzati sul ruolo delle molecole carotenoidi nel meccanismo di trasferimento di energia tripletto-ripletto in complessi antenna naturali. Attraverso la spettroscopia EPR, si sono sfruttate le proprietà magnetiche degli stati di tripletto dei caroteni per caratterizzare i cammini di trasferimento di energia in quattro diversi complessi antenna: la proteina LHC-II caratteristica delle piante superiori, le proteine LHC e PCP caratteristiche dei dinoflagellati ed i clorosomi caratteristici dei batteri verdi sulfurei. Queste proteine sono state selezionate come campione rappresentativo della variabilità nelle strategie di fotoprotezione adottate dai diversi organismi fotosintetici. I risultati ottenuti con rilevanza fisiologica possono essere schematizzati come segue: - Tra tutti i pigmenti presenti in ogni proteina considerata, solo specifici carotenoidi sono deputati alla dissipazione dell’energia di tripletto delle clorofille. Vale la pena notare che le proteine considerate appartengono ad organismi distanti nella scala evolutiva. Sembra perciò che la presenza di specifiche ‘trappole di energia’ sia centrale nella fotoprotezione giocata dai trasferimenti di energia tripletto-tripletto - I dati EPR non mostrano alcuna evidenza circa la formazione di eccitoni di tripletto che coinvolgano caroteni e clorofille. Inoltre, permettono di escludere la presenza trasferimenti multipli di energia di tripletto tra carotenoidi. Perciò, la presenza di uno stato di tripletto di carotenoide localizzato sembra essere una caratteristica comune a tutti i complessi antenna considerati. - La distribuzione della densità elettronica dello stato di tripletto lungo la catena coniugata della molecola di carotenoide non risulta essere particolarmente influenzata dalla presenza di sostituenti chimici: presenta la stesso andamento e la stessa estensione anche tra carotenoidi con strutture chimiche molto differenti. Questa evidenza rende la geometria relativa della coppia clorofilla/carotenoide coinvolta nel trasferimento di energia non particolarmente dipendente dalla distanza tra i centri dei sistemi coniugati delle due molecole. Mentre sembra che la minima distanza tra i sistemi coniugati sia il requisito strutturale fondamentale. - Il trasferimento di energia tripletto-tripletto nei complessi antenna sembra essere correttamente descritto dal meccanismo di super-scambio che coinvolge un ponte molecolare intercalato tra la coppia clorofilla/carotenoide. Questo ponte è rappresentato dal quinto legando dell’atomo di Mg legato al centro della molecola di clorofilla. Gli esperimenti ENDOR ed i calcoli DFT condotti supportano questa conclusione: la densità elettronica più alta riscontrata appartiene all’atomo di carbonio più vicino al quinto legando dell’atomo di Mg. Verosimilmente il ponte molecolare aumenta la velocità di trasferimento di energia garantendo un processo molto efficiente. Parallelamente a questi conclusioni ‘funzionali’, questa tesi dimostra anche come le tecniche EPR, applicate allo studio di molecole coinvolte nei trasferimenti di energia tripletto-tripletto, possano essere utilizzate per ricavare informazioni strutturali quando la struttura cristallografica non sia nota. Infatti, poiché la loro forma spettrale dipende direttamente dalla geometria della coppia coinvolta nel trasferimento di energia di tripletto, gli spettri EPR possono essere opportunamente impiegati per estrarre vincoli sperimentali da impiegare nella modellizzazione di strutture proteiche. In ambito fotosintetico questo risultato è particolarmente rilevante dal momento che molte proteine coinvolte nel processo sono grandi, di membrana e legano molti cofattori. Tutte queste caratteristiche costituiscono importanti limitazioni nell’utilizzo della diffrazione ai raggi x o delle tecniche NMR.