Caratterizzazione dei fattori sigma micobatterici SigE e SigF Caratterizzazione del dominio PPE della proteina PPE17 di Mycobacterium tuberculosis

Riassunto Mycobacterium tuberculosis (MTB) è l’agente eziologico della tubercolosi, patologia che nel mondo causa ogni anno due milioni di morti, con un’incidenza drammatica specie nei Paesi in via di sviluppo. Per poter trovare nuove strategie farmacologiche e vaccinali contro MTB è di fondamentale importanza lo studio dei meccanismi, che permettono la sua sopravvivenza ai vari stress ambientali, ai quali è sottoposto durante il periodo di infezione e latenza nei macrofagi dell’ospite. La fine regolazione della trascrizione di geni specifici in risposta a condizioni di stress e la peculiare struttura della sua parete giocano in merito un ruolo fondamentale. Nella prima parte del progetto di dottorato sono stati caratterizzati due fattori di trascrizione sigma micobatterici, SigE e SigF, che regolano la trascrizione di geni specifici in risposta a vari tipi di stress ambientali, come lo stress di superficie, lo stress ossidativo, il pH alcalino e lo shock termico. Anzitutto è stata studiata la regolazione trascrizionale, traduzionale e posttraduzionale del fattore di trascrizione con funzione extracitoplasmatica (ECF) SigE. Per quanto riguarda lo studio della regolazione trascrizionale, è stato possibile confermare tramite esperimenti di 5’RACE PCR e RT-PCR la presenza di tre promotori di sigE, e a dosare, a seconda delle condizioni ambientali di crescita batterica, il contributo di ciascun promotore nella trascrizione di questo gene. Dato che l’inizio della trascrizione di uno di questi promotori è sito 63 paia di basi a valle del codone di start annotato nel genoma, si è aperta l’ipotesi dell’esistenza di due isoforme di SigE. Mediante fusioni traduzionali tra specifiche sequenze di sigE con lacZ, private del proprio codone di inizio della traduzione, e successive mutagenesi sito-specifiche, è stato possibile confermare, in base all’attività beta-galattosidasica rilevata, l’esistenza di due codoni di start alternativi, un ATC ed un TTG, che codificano per un’isoforma di rispettivamente 218 e 215 di amminoacidi, oltre all’ATG già annotato nel genoma di MTB, che codifica per un’isoforma di 257 amminoacidi. Infine è stato possibile confermare, che il gene a valle di sigE codifica per il fattore anti-sigma di SigE, denominato RseA, in grado di legare entrambe le isoforme di SigE. In un secondo progetto è stato studiato anche il ruolo del fattore SigF di M. smegmatis nella biosintesi di pigmenti carotenoidi, nella resistenza a perossido d’idrogeno e nell’efficienza di trasformazione batterica. Tramite RT-PCR è stato dimostrato che SigF controlla la trascrizione di geni coinvolti nella biosintesi dei pigmenti carotenoidi, e, partendo dal presupposto che essi fungono da protezione contro i radicali liberi, è stato verificato che il mutante per il gene sigF è effettivamente più sensibile rispetto al ceppo selvatico al trattamento con perossido d’idrogeno. Infine è stato dimostrato anche, che il ceppo mutante possiede una maggiore efficienza di trasformazione rispetto al ceppo selvatico, indicando che SigF regola probabilmente la trascrizione di geni coinvolti nella permeabilità della parete. Nella seconda parte del progetto è stata caratterizzata la localizzazione della proteina PPE17 sulla superficie micobatterica. Come altri membri della famiglia PPE, la PPE17 presenta un dominio N-terminale altamente conservato, il quale, in base a diverse evidenze in letteratura, si suppone svolgere un ruolo importante per la loro traslocazione in superficie. Inoltre, si è voluto verificare un’eventuale influenza della presenza della proteina PE11 nel processo di traslocazione in o nella stabilità della PPE17, in quanto la sequenza codificante la PE11 è in tandem e co-trascritta con quella codificante la PPE17, e vi è un’interazione specifica tra queste due proteine. I dati ottenuti mediante saggi di sensibilità alla proteinasi K su ceppi di M. smegmatis, esprimenti la PPE17 intera o solo il suo dominio PPE (dPPE17) fuse all’epitopo HA, confermano che la PPE17 intera sia esposta in superficie, sia in presenza che in assenza di PE11. In base ai dati ottenuti si è infine tentato di veicolare un antigene modello (Mpt64) di MTB sulla superficie del ceppo vaccinale M. bovis BCG fondendolo con il dPPE17. Saggi di sensibilità alla proteinasi K e ELISA su cellule intere effettuati su culture di M. bovis BCG esprimenti questa proteina chimerica indicano, che essa sia effettivamente localizzata a livello superficiale. Allo stesso modo sono state costruite due ulteriori fusioni con il dPPE17 per esprimere sulla superficie micobatterica l’antigene multimerico Ag85-ESAT6 di MTB e l’antigene Csp C3 di Plasmodium berghii. In base a saggi di sensibilità alla proteinasi K svolti su ceppi di M. smegmatis esprimenti le due fusioni anche in questo caso entrambe localizzano in superficie. I ceppi di M. bovis BCG esprimenti questi antigeni sulla loro superficie saranno testati in futuro nel modello del topo per misurare un eventuale aumento della protezione rispetto al ceppo selvatico.