Analysis of allergenic proteins by mass spectrometry

Analisi di proteine allergeniche mediante spettrometria di massa. Le allergie alimentari rappresentano ormai una problematica clinica di livello mondiale. Tra i prodotti alimentari considerati pericolosi per il loro elevato contenuto in proteine allergeniche troviamo il latte bovino, le uova, la soia e le arachidi. Le proteine allergeniche possono scatenare reazioni allergiche sia mantenendo la loro struttura nativa, sia in seguito a modifiche chimiche e conformazionali indotte dai processi industriali. I metodi d’elezione applicati per l’identificazione di proteine allergeniche negli alimenti sono rappresentati dai saggi immunochimici come i test ELISA. Tali metodi presentano però numerose limitazioni causate da fenomeni di cross reattività e da falsi positivi. Inoltre, alterazioni nella struttura delle proteine allergeniche o eventuali modifiche chimiche possono modificare l’interazione con gli anticorpi specifici, invalidando i risultati. Dal momento che gli allergeni sono tossici anche in tracce, è necessario sviluppare dei metodi analitici efficaci e affidabili per la loro identificazione. Lo scopo di questo progetto di tesi è stato quello di sviluppare delle procedure per l’identificazione di proteine allergeniche mediante spettrometria di massa (MS) che possano superare i limiti metodici dei saggi immunologici. Oltretutto, l’identificazione delle proteine mediante MS si basa sull’analisi della sequenza amminoacidica di quest’ultime, mentre i saggi immunochimici sono strettamente dipendenti dall’integrità della struttura tridimensionale della proteina antigenica. Al fine di testare la validità dell’approccio immnuchimico, sono stati testati alcuni anticorpi policlonali diretti contro le principali proteine allergeniche di latte α-lattalbumina e β-lattoglobulina) e uova (ovomucoide, ovalbumina e lisozima). Sono stati condotti alcuni studi preliminari per validare la qualità di questi anticorpi, in termini di specificità di riconoscimento della proteina antigenica e della presenza di eventuali fenomeni di cross reattività. Inoltre, è stata valutata la risposta anticorpale usando come antigeni sia le proteine commerciali purificate, sia le stesse proteine contenute in prodotti alimentari prima e dopo trattamento termico. Dato che le proteine allergeniche sono contenute in miscele complesse costituite da altre proteine, è stata considerata estremamente appropriata l’applicazione di una tecnica detta “targeted chromatography”. Secondo questo strategia, è possibile identificare mediante MS una proteina contenuta in una miscela complessa attraverso l’analisi di alcuni frammenti peptidici derivati dalla digestione triptica, che sono specifici della proteina stessa. Questa procedura prevede la modifica chimica e il successivo isolamento di specifici peptidi detti “prototipici”. A tale scopo, i residui di triptofano contenuti nelle proteine sono stati chimicamente modificati mediante una reazione con il composto 2,4- dinitrofenilsulfenil cloruro (DNPS-Cl), che porta alla formazione di un derivato triptofanilico, con il DNPS legato in posizione 2 dell’anello indolico. La selezione dei peptidi modificati con il DNPS-Cl contenuti in una miscela triptica è stata effettuata sfruttando l’aumento di idrofobicità e del tempo di ritenzione di questi peptidi modificati in una colonna HPLC a fase inversa. Inoltre, gli stessi peptidi modificati con DNPS-Cl sono stati isolati mediante cromatografia per immunoaffinità utilizzando una resina derivatizzata con anticorpi monoclonali diretti contro il gruppo DNP. La strategia di ”targeted proteomics” è stata ottimizzata utilizzando una miscela modello di sette proteine e successivamente è stata applicata per l’identificazione di una proteina allergenica contenuta in un prodotto dolciario. È stato inoltre dimostrato che queste nuove procedure di modifica selettiva e di selezione dei peptidi triptofanilici permette di semplificare considerevolmente l’analisi di fingerprinting/MS che è solitamente utilizzata per l’identificazione di proteine nei protocolli di proteomica. Altre attività di ricerca. Durante il periodo di dottorato, ho avuto l’opportunità di collaborare con altri membri del laboratorio in due progetti addizionali come continuazione di un progetto di ricerca precedente. La documentazione relativa a queste attività è riportata in appendice alla tesi di dottorato. Sono state investigate le proprietà molecolari del complesso formato da α-lattalbumina con l’acido oleico. Il complesso appare interessante poiché ha mostrato avere tossicità cellulare diretta selettivamente contro cellule tumorali. È stato dimostrato che la proteina nel complesso ha una struttura oligomerica, diversamente da quanto riportato nelle prime osservazioni, che ipotizzavano fosse in uno stato monometrico. Inoltre, è stato osservato che l’acido oleico interagisce anche con altre proteine, come l’apomioglobina. La principale conclusione di questo lavoro è stata che il motivo oligomerico della proteina veicola l’acido oleico, normalmente poco solubile, favorendo quindi la solubilizzazione dell’acido grasso e conseguentemente della sua proprietà citotossica. È in preparazione un articolo riguardante questi risultati. L’enterocina AS-48, è un polipeptide circolare di 70 residui prodotto da Enterococcus faecalis che mostra a vere attività antibatterica. La proteolisi limitata è stata usata per preparare una forma lineare e due frammenti di questa enterocina. Misure di dicroismo circolare nel lontano ultravioletto hanno dimostrato che la proteina ha una bassa ellitticità e una ridotta stabilità alla denaturazione termica, ma mantiene la sua attività antibatterica., mentre i frammenti presentano un’attività ridotta. Questi risultati indicano che la circolarizzazione è un fenomeno che non è richiesto per l’attività antibatterica, ma è cruciale per la stabilizzazione della struttura nativa. Questa ricerca è stata pubblicata in FEBS Lett. (2008).