Valutazione di nuovi target terapeutici in tumore del surrene e ruolo di sonic hedgehog nella biologia della ghiandola surrenalica

Introduzione: I tumori surrenalici benigni sono relativamente comuni con un’incidenza del 3-7%. Invece i tumori maligni, o carcinomi della corticale del surrene (ACC), sono piuttosto rari ma altamente maligni e presentano una prognosi infausta. La somatostatina (SST) è un polipeptide ampiamente distribuito che modula la secrezione endocrina ed esocrina, la proliferazione cellulare e l'apoptosi tramite cinque recettori somatostatinici (SSTR1-5). Gli effetti inibitori della somatostatina sulla crescita tumorale possono essere il risultato della soppressione della sintesi e/o del rilascio di fattori di crescita e ormoni promuoventi la crescita. Octreotide e SOM230 sono analoghi multi-ligando di SST con alta affinità per i recettori SST L’espressione dei recettori SST è stata dimostrata in ghiandole surrenali umane mediante immunoistochimica, ma poche sono le informazioni disponibili riguardanti l’efficacia di analoghi della somatostatina in ACC. Studi precedenti hanno mostrato che un agonista selettivo di SSTR1 inibisce il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) e l’espressione del suo recettore (VEGFR2). È stato inoltre descritto un nuovo fattore angiogenico specifico dei tessuti steroidei (EG-VEGF), e il suo ruolo nei tumori surrenalici è attualmente ignoto. La capacità di alcuni tumori di sfuggire alle terapie anti-angiogeniche potrebbe essere dovuta, almeno in parte, all'espressione di molecole angiogeniche organo-specifiche, come EG-VEGF. Scopo dello studio: In letteratura, pochissime informazioni sono disponibili sull'effetto di analoghi della somatostatina in tumori surrenalici; pertanto scopo di questo studio è quello di analizzare l'espressione di SSTRs e di fattori angiogenici nei tumori cortico-surrenalici, nonché di osservare l'effetto di un analogo della somatostatina (il SOM230) sulla secrezione ormonale, sulla vitalità cellulare e sull’angiogenesi in cellule surrenaliche. Materiali e Metodi: Tramite real-time PCR quantitativa (qPCR) è stata analizzata l’espressione dei recettori SST e dei fattori angiogenici in 13 carcinomi della corticale del surrene (ACC), in 24 adenomi secernenti aldosterone (APA), in 11 adenomi secernenti cortisolo (CPA) e in 7 ghiandole surrenali normali (NA); successivamente si è verificata l’espressione di 4 SSTR mediante analisi immunoistochimica in 14 campioni. L'effetto di SOM230 sulla secrezione di cortisolo o di aldosterone in colture di cellule H295R e in colture primarie è stato determinato mediante RIA, e l'effetto sulla vitalità di cellule H295R con MTT test.I livelli di espressione di VEGF e EG-VEGF dopo trattamento di cellule H295R con SOM230 sono stati studiati mediante qPCR. Risultati: L’mRNA per SSTR1 e SSTR2 è stato espresso nel 100% dei tumori surrenalici. ACC ha dato un aumento in quasi tutti i SSTR, laddove solo alcuni APA, comparati con NA, overesprimevano SSTR3 e SSTR1. CPA esprimevano SSTR similmente a NA. L’immunoistochimica ha confermato i dati relativi all'espressione di mRNA. Inoltre SOM230 a concentrazioni nanomolari ha inibito la secrezione ormonale in colture primarie e in cellule H295R ma, come per il trattamento con octreotide, non ha sortito alcun effetto sulla vitalità cellulare. L’mRNA di VEGF, VEGFR1, VEGFR2 e EG-VEGF era altamente espresso in tutti i nostri tessuti; i livelli di PROKR1erano invece bassi, inoltre abbiamo trovato la presenza di questo gene nel 72,2% di ACC e CPA e nel 90%di APA. Il 64% degli ACC aveva VEGF e EG-VEGF overespressi, mentre gli APA avevano una marcata overespressione di VEGF e VEGFR1. Il pattern d’espressione dei CPA era simile a quello dei NA. SOM230 inibisce anche l’espressione dell’mRNA di VEGF e EG-VEGF alle concentrazioni di 10-6M and 10-8M in cellule H295R. Conclusioni: Le evidenze della sovraespressione di SSTR (in particolare in ACC) e l’inibizione della secrezione ormonale da parte di SOM230 suggerisce un potenziale ruolo terapeutico per questo analogo ad ampio spettro della somatostatina nei tumori surrenalici. Questa idea è supportata anche dall’overespressione dei fattori angiogenici trovata in ACC e APA e dagli effetti inibitori esercitati da SOM230 su due di essi. Introduzione (I): Lo sviluppo del surrene nel mammifero è regolato da una complessa rete di fattori di crescita e di trascrizione. La corteccia surrenalica è un tessuto endocrinologico steroidogenico critico, generata almeno in parte dall’epitelio celomico della cresta urogenitale. Né i segnali intracellulari che regolano lo sviluppo e il mantenimento della corteccia, né le relazioni tra i diversi lineage nel surrene sono ben definiti Sonic Hedgehog (Shh) è un ligando della famiglia Hedgehog (Hh) e le sue maggiori funzioni sono state trovate nel patterning degli assi corporei, nella specificazione del fato di una cellula, nella proliferazione e nella sopravvivenza cellulare. Gli1, Gli2 e Gli3 sono fattori di trascrizione regolati trascrizionalmente da Smoothened (Smo), un recettore inibito da Patched in assenza di Hh. Inoltre, diversi studi hanno osservato la connessione tra la via di segnalazione di Shh e quella di Wnt, un pathway molto importante nello sviluppo surrenalico e nella formazione di tumori del surrene. Scopo dello studio (I): Oggi molto poco è conosciuto sul ruolo di Shh nella biologia del surrene. Scopo di questo studio è caratterizzare l’espressione dei componenti della via di segnalazione di Hh, in particolare di Gli1 con analisi molecolari e istologiche, nella ghiandola surrenalica di modelli murini, e di studiare molecolarmente e istologicamente, mediante immunofluorescenza, i fenotipi di un modello murino caratterizzato da un’espressione costitutivamente attiva di Smo. Materiali e metodi (I): Analisi di qPCR e RT-PCR sono state condotte su RNA estratto da surreni di topi wild type (wt) e da cellule Y1; reazioni di RT-PCR per i ligandi Wnt sono state eseguite su RNA proveniente da animali transgenici e dai loro controlli. Surreni di topi reporter per l’espressione di Shh, Ptch e Gli1 sono stati sottoposti a X-gal staining per individuare la loro espressione nei tessuti. Per localizzare l’espressione del gene Gli1 nel tessuto surrenalico sono stati fatti i seguenti incroci. Topi Gli1CreERT2 sono stati incrociati con topi reporter R26R. Per lo studio embriologico, femmine di topo gravide sono state iniettate intraperitonealmente (IP) con tamoxifen (100mg/kg) nel giorno 13,5dpc. Gli animali sono stati sacrificati ai seguenti time point: 16,5dpc, 18,5dpc e P1. Per studi sugli adulti, topi Gli1CreERT2-R26R portanti in eterozigosi entrambi i transgeni, sono stati iniettati con tamoxifen 100mg/kg/die dal ventunesimo giorno di vita (P21) per 14 giorni, sono stati poi raccolti i tessuti a 9, 25 e 57 settimane d’età e sottoposti a X-gal staining. Per sovraesprimere Smo nelle cellule positive a Gli1, topo Gli1CreERT2 sono stati incrociati con topi SmoM2EYFP. Femmine gravide sono state iniettate IP con tamoxifen e sacrificate a 16,5 o 18,5 dpc, oppure i tessuti sono stati raccolti da cuccioli di topo di un giorno di vita. Topi eterozigoti Gli1CreERT2-SmoM2EYFP sono stati iniettati dal P21 con tamoxifen per 14 giorni. I tessuti sono stati raccolti a 5, 10 o 28 settimane di vita. I tessuti sono stati sottoposti a immunofluorescenza. Risultati (I): Abbiamo trovato la presenza di tutti i geni coinvolti nella via di segnalazione di Hh nel surrene wt, con l’eccezione di Ptch2; Shh è il ligando della famiglia Hh più espresso nel surrene wt. Abbiamo trovato la sua espressione nella regione sotto-capsulare del surrene, mentre Ptch1 e Gli1 erano nella capsula surrenalica. Gli1 è espresso nella capsula sia negli embrioni che nei topi adulti, inoltre abbiamo osservato gruppi di cellule positivi per Gli1 nella corteccia surrenalica. La sovraespressione di Smo negli adulti porta ad uno strato di cellule capsulari positive per COUPTFII più sottile, ad un incremento della proliferazione ed a un’espressione di β-catenina più diffusa (a 28 settimane) o più forte (a 10 settimane). I risultati sono stati confermati mediante qPCR svolta su RNA estratto dai surreni controlaterali. Per investigare quale ligando Wnt possa essere coinvolto in questo processo, abbiamo determinato mediante RTPCR che, rispetto ai nostri controlli, vi era un cambiamento nell’espressione di Wnt2a, Wnt4, Wnt5a e 5b, Wnt11 e Wnt 15. Negli embrioni abbiamo osservato un aumento delle dimensioni del surrene e delle cellule proliferanti. Conclusioni (I): In questo studio abbiamo trovato l’espressione dei geni coinvolti nella via di segnalazione di Hh nel surrene, inoltre abbiamo osservato che l’espressione di Shh è localizzata nella zona subcapsulare del surrene, mentre quella di Ptch e Gli1 è confinata nella capsula surrenalica. Abbiamo però osservato che cellule Gli1-positive, organizzate in piccoli gruppi, migrano in maniera centripeta e diventano parte della corteccia surrenalica, supportando l’idea che la capsula surrenalica sia la sede di progenitori cellulari. L’overespressione di Smo nelle cellule esprimenti Gli1 ha aumentato la proliferazione e al contempo è risultata in una capsula più sottile, perciò nel prossimo futuro studieremo quale popolazione cellulare è diminuita nella capsula. Abbiamo inoltre notato un aumento dell’espressione di β-catenina e/o delle cellule esprimenti β-catenina nei diversi time point, abbiamo quindi analizzato quale ligando Wnt è espresso in maniera diversa rispetto ai nostri controlli mediante RT-PCR, e adesso approfondiremo l’analisi mediante qPCR. Tutti i risultati ottenuti sono promettenti perché abbiamo individuato un ruolo importante delle cellule esprimenti Gli1 e, allo stesso tempo, una potenziale relazione tra le vie di Wnt e Shh nello sviluppo e nel mantenimento del surrene