Site-specific modification of proteins by transglutaminase

Modifica sito-specifica di proteine con transglutaminasi La transglutaminasi (TGasi; EC 2.3.2.13) catalizza la reazione tra il gruppo γ-ammidico di un residuo di Gln (-CONH2, accettore) ed un gruppo amminico (-NH2, donatore) di una alchil-ammina (proteina-CONH2 + H2N-ligando → proteina-CONH-ligando + NH3). Con substrati proteici la TGasi determina una reticolazione intra- e inter-molecolare di proteine mediante la formazione di un legame isopeptidico tra le catene laterali dei residui di Gln e Lys. Il donatore acilico può essere anche un ammido-ligando in grado di mimare la catena laterale di Gln e, pertanto, la TGase consente una modifica di proteine a livello dei residui di Gln o Lys utilizzando opportuni reagenti. Recentemente, la TGase microbica da S. mobaraensis ha suscitato un notevole interesse per la modifica enzimatica di proteine, considerando la sua stabilità, elevata reattività e piccole dimensioni. La struttura ai raggi-X di questa TGase ha rivelato la presenza di un sito attivo costituito da una triade Cys-His-Asp in analogia al sito attivo di una proteasi. Recenti studi hanno dimostrato che le reazioni mediate da TGase possono essere sito-specifiche, portando talvolta alla modifica di un solo residuo Gln tra i molti residui Gln di un substrato proteico. D'altra parte, è stata accertata solo una moderata specificità per i residui di Lys. Con lo scopo di chiarire i motivi strutturali che determinano la specificità di azione della TGase, in questa Tesi sono state studiate una serie di reazioni TGase-mediate utilizzando proteine di struttura e dinamica note, come apomioglobina (apoMb), lisozima da bianco d’uovo (LYS) e ribonucleasi pancreatica bovina (RNase). Sono stati utilizzati sia ammino- che ammido-ligandi nelle reazioni con TGase ed in tal modo è stato possibile analizzare la specificità di modifica sia a livello di Gln che di Lys con le proteine esaminate. E’ stata accertata una specificità rigorosa delle reazioni TGase-mediate a livello di Gln91 di apoMb, un residuo localizzato nel segmento corrispondente all’elica F della proteina nativa e risultato molto flessibile o unfolded in apoMb da precedenti misure NMR e da dati di proteolisi limitata. Anche un ligando in grado di mimare il residuo di Gln può essere legato da TGase a livello di una Lys incorporata nello stesso segmento flessibile. Pertanto, è stato concluso che una elevata flessibilità locale o unfolding determina la reazione sito-specifica di TGase. Mentre con la RNase si può ottenere con TGase ed un ammido-ligando la specifica modifica a livello del gruppo ɛ-aminico di Lys1, la simile Lys1 del LYS non reagisce affatto in simili condizioni. E 'stato possibile mettere in relazione questo fatto con la flessibilità e la rigidità della regione N-terminale di RNase e LYS, rispettivamente, sulla base dei valori del fattore-B (correlato alla flessibilità della catena polipeptidica) di queste due proteine ottenuti da dati cristallografici. Un derivato di RNase con il singolo legame peptidico Asn34-Leu35 idrolizzato (RNase Th1) ed un derivato di LYS con un ponte disolfuro ridotto (LYSCM6, 127) sono risultati molto più reattivi nelle reazioni con TGase rispetto alle corrispondenti proteine native, in accordo con la loro maggiore flessibilità o parziale denaturazione. Inoltre, abbiamo potuto dimostrare che i siti o regioni suscettibili di reazioni con TGase subiscono anche fenomeni di proteolisi limitata, significando che sia la TGase che una proteasi necessitano di un local unfolding per determinare una reazione enzimatica sito-specifica. In effetti, questo è linea con il fatto che il bioriconoscimento del substrato è simile per entrambi gli enzimi, considerando il fatto che la TGase è una proteasi inversa (sintesi invece che idrolisi di una ammide). Un risultato interessante di questi studi risiede nel fatto che si apre la strada ad un nuovo metodo enzimatico di binding covalente di poli(etilene)glicole (PEG) a livello di specifici residui di Gln in proteine di interesse farmaceutico. Infatti, utilizzando TGase ed un ammino-derivato di PEG (PEG-NH2), è stato possibile preparare derivati peghilati omogenei di apoMb, ormone della crescita umano (hGH) e granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF). In generale, i risultati ottenuti hanno indicato chiaramente che le reazioni selettive di TGase richiedono un substrato flessibile o unfolded. Pertanto, è possibile prevedere i siti di attacco di TGase su un substrato proteico, se sono note la sua struttura e dinamica. Considerando la crescente importanza dei farmaci proteici peghilati e le speciali richieste di omogeneità dettate dalle autorità regolatorie, si può prevedere che la peghilazione sito-specifica con TGase di proteine di interesse farmaceutico troverà utili applicazioni.