Fret imaging and optogenetics shed light on neurocardiac regulation in vitro and in vivo

Il cuore è densamente innervato dai neuroni del sistema nervoso simpatico che regolano la funzionalità cardiaca attraverso un effetto cronotropo o inotropo positivi. Durante lo stress o l’esercizio, la noradrenalina rilasciata dai neuroni attiva i β recettori cardiaci sia sul sistema di conduzione che sul muscolo contrattile. L’aumento dell’attività del sistema nervoso simpatico cardiaco sia in condizioni normali o in presenza di patologie genetiche, come per esempio la Tachicardia Catecolaminergica Polimorfica Ventricolare, porta ad aritmie presumibilmente attraverso l’insorgere di ‘DADs’. Le ‘DADs’ sono un focus di aritmia che porta a una serie di depolarizzazioni che interessano un piccolo gruppo di cellule cardiache. E’ stato identificato un rilascio di catecolamine non bilanciato in diverese regioni del cuore da parte del sistema nervoso simpatico come possibile causa di aritmia. Inoltre alterazioni del ‘reuptake’ di noradrenalina porta a una concentrazione anomala di NE nello scompenso cardiaco che può essere coinvolto in un evento aritmico. Questi dati supportano un modello in cui il controllo della funzionalità cardiaca da parte del sistema nervoso simpatico avviene attraverso un sito d’interazione diretta e specializzata fra neurone e cardiomiocita accoppiato. Gli scopi del progetto sono quindi: 1. Studiare se l’interazione fra neurone e cardiomiocita ha un ruolo nella trasmissione cardiaca del segnale, per capire come un’attività non bilanciata del sistema nervoso simpatico porta a un evento aritmico. 2. Capire se l’attività non bilanciata del sistema nervoso simpatico modulando l’attività di un piccolo gruppo di cellule cardiache, possa essere coinvolto nella generazione di un’aritmia in vivo. Per verificare quest’ipotesi ci serviremo di un approccio innovativo basato su proteine foto attivabili 3. Studiare in vivo e in maniera non invasiva la massa critica di cellule cardiache necessaria per scatenare un evento aritmico. Anche per questo tipo di studio abbiamo utilizzato una metodologia basata sull’optogenetica. Nella prima parte del progetto, abbiamo creato un modello in vitro costituito da cardiomiociti neonatali e neuroni isolati dal ganglio cervicale superiore. I neuroni in seguito a trattamento con NGF sviluppano assoni che stabiliscono contatti con i cardiomiociti. Sotto terminali che sono in contatto con le cellule cardiache si osserva un maggiore accumulo di β1 recettori [3]. Abbiamo misurato l’attivazione dei β recettori monitorando in tempo reale le variazioni di AMP ciclico e attività di PKA, attraverso l’uso di sensori geneticamente codificati e che si basano sul FRET (EPAC1-camps, che ci permette di monitorare cAMP e AKAR3 che ci permette di monitorare l’attività di PKA). I neuroni del SNS sono stati stimolati con KCl o bradichinina. Abbiamo osservato che stimolando il rilascio di noradrenalina da un neurone, l’AMP ciclico e l’attività di PKA aumentano solo nei cardiomiociti accoppiati a neurone e non nei cardiomiociti senza un contatto (ΔR/R0 = 0.056 ± 0.01 mean ± SEM, n = 8, AKAR3 ΔR/R0=5.3% ± 1.5%, mean ± SEM, n=6). Per stimare la [NE] che agisce sui β recettori nel sito di contatto abbiamo paragonato l’ampiezza del segnale FRET generato dall’attivazione neuronale (ΔR/R0= 0.026 ± SEM) con quello generato da diverse [NE] note aggiunte alla soluzione in cui si trovano le cellule. Abbiamo osservato che l’aumento del rapporto CFP/YFP ottenuto dalla noradrenalina rilasciata dai neuroni e paragonabile a quello ottenuto con 3.5e-10 M di noradrenalina che attiva tutti i recettori. Usando un antagonista competitivo dei β recettori (propranololo) abbiamo determinato la concentrazione di noradrenalina nel cleft sinaptico. La concentrazione di propranolol necessaria per abolire totalmente la risposta indotta dalla noradrenalina rilasciata dai neuroni, e pari a quella necessaria per bloccare la risposta indotta da 100 nM di noradrenalina, suggerendo che la concentrazione nel cleft sinaptico è dell’ordine di 100 nM. Sulla base di questi dati abbiamo quindi calcolato che la frazione recettoriale con cui interagisce la noradrenalina rilasciata dai neuroni che è inferiore all’1% del totale. 1.Nella seconda parte del progetto abbiamo usato una strategia che si basa sull’‘optogenetica’ per modulare l’attività del sistema nervoso simpatico in vivo e in maniera non invasiva. ChR2 è un canale la cui permeabilità è regolata dalla luce. Infatti questo canale diventa permeabile soprattutto al Na+ in seguito a stimolazione con luce blu. Negli ultimi anni è stato largamente utilizzato per il controllo dell’attività neuronale sia in vitro che in vivo [4, 5]. Abbiamo generato un modello murino che esprime ChR2 nei neuroni del sistema nervoso simpatico sotto il promotore tirosina idrossilasi. La foto stimolazione del ganglio stellato è stata ottenuta in un modello a ‘torace aperto’ di topo anestetizzato, usando una fibra ottica per indirizzare in uno specifico punto la luce generata da un LED. L’analisi dell’ECG del topo mostra un rapido (100-150 ms) aumento (40%±6%) nella frequenza di contrazione cardiaca in seguito a ‘fotostimolazione’ del ganglio stellato. Questo rapido aumento nella frequenza cardiaca supporta il modello in cui la noradrenalina agisce in uno spazio piccolo e confinato in cui neurone e cardiomiocita interagisccono direttamente. 3. Abbiamo usato ChR2 anche per modulare l’elettrofisiologia cardiaca. Abbiamo determinato che la fotostimolazione di ChR2 è sufficiente a modulare il potenziale d’azione in cardiomiociti neonatali in cultura. Inoltre a seconda di quando viene dato il pulso di luce siamo in grado di generare un battito normale, una DAD o una EAD. Abbiamo quindi generato un modello di topo che esprima ChR2 nel cuore sotto il promotore α-MHC. Abbiamo controllato tramite stimolazione luminosa il potenziale d’azione di cellule cardiache utilizzando fibre ottiche alimentate da LED, durante l’acquisizione dell’ECG del topo. La stimolazione è stata eseguita in diverse regioni del cuore. La stimolazione atriale ci ha permesso di mimare un pacing atriale sfociato poi una tachicardia. Abbiamo osservato che il QRS non ha variazioni rispetto al normale, indicando che l’onda di depolarizzazione segue il sistema di conduzione cardiaco. La foto attivazione ventricolare invece genera un battito prematuro dato che non segue il sistema di conduzione. Abbiamo qui dimostrato l’esistenza di un contatto sinaptico fra i neuroni e i cardiomiociti che forma un sito a elevata concentrazione di neurotrasmettitore, uno spazio a diffusione limitata permettendo quindi l’attivazione di un ristretto gruppo di recettori β localizzati nella membrana della cellula cardiaca. La stimolazione neuronale genera un rapido aumento nella frequenza cardiaca avvalorando l’ipotesi dell’esistenza di un contatto sinaptico fra neuroni e cardiomiociti. Questa interazione è importante per un controllo rapido del segnale locale dei cardiomiociti, suggerendo che i neuroni controllino un gruppo ristretto di cellule cardiache. La stimolazione di una frazione di cardiomiociti è sufficiente a indurre un battito condotto in tutto il cuore