Development of new tools to explore organelle calcium dynamics in vivo: a new fret-based calcium sensor and a mitochondria targeted channelrhodopsin

La prima parte di questa tesi si propone di sviluppare nuovi strumenti per esplorare l'omeostasi del calcio (Ca2+) mitocondriale in vivo, migliorando la sonda Cameleon indirizzata ai mitocondri, già presente in laboratorio, e creando un canale regolato dalla luce (Channelrhodopsin) indirizzato a sua volta ai mitocondri. Gli indicatori per il Ca2+ geneticamente codificati (Genetically encoded calcium indicators, GECIs), consentono di eseguire misure quantitative di Ca2+ in diversi modelli sperimentali. Segnali di indirizzamento a specifici organelli possono essere fusi con la sequenza codificante i GECIs, consentendo di misurare variazioni della concentrazione di Ca2+ in diversi compartimenti subcellulari. Inoltre, le sequenze codificanti i GECIs possono essere poste sotto il controllo di promotori tessuto-specifici o inducibili, consentendo così il controllo spaziale e temporale della loro espressione. Diversi tipi di GECIs sono stati creati: nel nostro laboratorio usiamo una classe di sensori Ca2+ basati su FRET, chiamati Cameleon. La microscopia FRET (trasferimento di energia di risonanza Förster) si basa sul trasferimento diretto di energia da una proteina fluorescente (FP), detta donatore, a un'altra FP, detta accettore, in una cellula vivente. Strutturalmente, la sonda Cameleon, è composta da due elementi responsivi per il Ca2+, che modificano l'efficienza di FRET tra le due FPs. All'interno di questa sonda sono infatti presenti due FPs: una proteina fluorescente di colore ciano (CFP), il donatore, e una proteina fluorescente gialla (cpV), l'accettore. I due elementi che rispondono a variazioni di Ca2+ sono la Calmodulina (CaM) e il dominio di legame della calmodulina (M13) della chinasi della catena leggera della miosina. Come anticipato, lo scopo del mio studio è lo sviluppo di sensori molecolari e di nuove metodologie per esprimere le sonde in vivo al fine di esplorare le dinamiche di Ca2+ di particolari organelli in vivo (in particolare nel cervello e nel cuore). Un limite delle sonde Cameleon, particolarmente critico per le applicazioni in vivo, è il basso grado di fluorescenza della CFP, che causa un basso rapporto segnale-rumore ed è caratterizzato da un tempo di vita multi-esponenziale, che indica la presenza di percorsi multipli di decadimento dallo stato eccitato. Recentemente è stata sviluppata una FP più luminosa e più stabile, rispetto alla CFP: mCerulean3. Quest'ultima ha elevata resa quantica di fluorescenza e alta fotostabilità, rendendo questa proteina un buon candidato alla sostituzione del donatore originale nelle sonde Cameleon. Per questo motivo, la CFP è stata sostituita con mCerulean3 in due differenti sonde Cameleon: la sonda citosolica D3cpv e la sonda mitocondriale 4mtD3cpv. Le nuove sonde sono state testate in diversi tipi cellulari: HeLa, cardiomiociti di ratto neonato e neuroni da topi neonati. Sono quindi stati misurati in situ vari parametri indicativi della qualità delle nuove sonde create, quali la luminosità, la fotostabilità, la sensibilità al pH e la costante di dissociazione (Kd), mostrando un netto miglioramento della luminosità e fotostabilità, rispetto alle sonde Cameleon originali. L'unico inconveniente delle nuove sonde è una riduzione del range dinamico, di circa il 20-30%, un parametro molto importante che rende conto della massima variazione del rapporto di fluorescenza emessa alle due lunghezze d'onda in seguito a variazioni di Ca2+. Al fine di sopperire a tale svantaggio, sono stati utilizzati diversi approcci, tra cui l'aggiunta di una sequenza di 16 glicine tra i due elementi responsivi al Ca2+ che ha consentito di recuperare il range dinamico della sonda mitocondriale e di aumentare del 20% quello della sonda citosolica, senza modificare i miglioramenti prima descritti, ottenuti con la semplice sostituzione del donatore. Parallelamente, poiché era stata osservata una scarsa localizzazione mitocondriale a 24 ore dalla trasfezione del 4mtD3cpV, anche la sequenza di indirizzamento è stata modificata (allungando ciascuna delle sequenze originali di 5 minoacidi), diminuendo notevolmente la quantità di sonda espressa erroneamente nel citosol. Come anticipato, l'effetto del pH è stato valutato, evidenziando una stabilità generale delle varie delle sonde tra pH 7 e pH 9. Infine, sono state calcolate le costanti di affinità delle varie sonde mitocondriali. Una doppia affinità per il Ca2+ è stata rilevata: la sonda 4mtD3cpV ha una Kd di 0.06 µM e una di 10.84 µM, mentre la sonda 4mtD3mCerulean3+16 ha una Kd di 0.03 µM e una di 10.7 µM. Per caratterizzare meglio le nuove sonde Cameleon, citosolica e mitocondriale, esse sono state prodotte in E.Coli e purificate per misurare anche in vitro tutti i parametri sopra descritti. Ad oggi sono stati ottenui solo dati preliminari che evidenziano una riduzione del range dinamico passando dall’ambiente citosolico (DR=3) a quello mitocodnriale (DR=2.5). Per quanto riguarda l’affinità per il Ca2+, solo poche concentrazioni di questo ione sono state testate, dando come risultato una Kd singola sia per la sonda mitocondriale che per quella citosolica. Tale dato dovrà essere confermato da ulteriori esperimenti. Tipicamente, le variazioni di Ca2+ rilevate da sonde basate su FRET vengono effettuate utilizzando metodi basati sull'intensità delle due proteine fluorescenti, tuttavia tecniche alternative basate sul tempo di vita della proteina sembrano dare risultati più accurati e robusti. Stiamo perciò iniziando a valutare biofisicamente le sonde Cameleon utilizzando la tecnica FLIM, tecnica che misura quanto tempo una molecola fluorescente resta nello stato eccitato. Il FLIM presenta diversi vantaggi in quanto è totalmente indipendente da fenomeni come il photobleaching, i diversi livelli di espressione, i cambi di fuoco. I dati prelimianri raccolti eveidenziano la presenza di fenomeni di homo-FRET nelle sonde testate, fenomeni che sembrano tuttavia essere meno evidenti nelle sonde in cui la CFP è stata sostituita da mCerulean3. Infine, per esprimere questi due nuove sonde in vivo stiamo applicando tre strategie: i) la creazione di un virus adeno-associato (sierotipo 9) con tropismo cardiaco; ii) la generazione di un altro virus adeno-associato (sierotipo 9) dotato di un promotore neurone specifico (sinapsina) per l'iniezione intracranica; iii) la creazione di topi transgenici. Queste strategie ci permetteranno di effettuare misurazioni in vivo di Ca2+ in diversi tessuti e compartimenti subcellulari. Recentemente, la generazione di un AAV9 per l'espressione del D3mCerulean3 e 4mD3mCerulean3 sotto il controllo di un promotore ubiquitario (CMV) ci ha consentito di osservare un buon livello di espressione nel cuore, iniettando il virus per via intraperitoneale in topi neonati. In conclusione, i risultati finora ottenuti rendono le nuove sonde Cameleon, basate su mCerulean3, una scelta interessante per gli esperimenti in vivo. Come anticipato, al fine di studiare il ruolo dei mitocondri in situ e in vivo, abbiamo anche approfittato di uno strumento optogenetico, le Channelrhodopsine (ChRs), canali appartenente alla famiglia delle opsine. I ChRs sono l'unico tipo di canali ionici, direttamente controllati dalla luce, in grado di indurre depolarizzazione della membrana plasmatica, se opportunamente illuminati. Per l'attivazione, le opsine richiedono il legame con un cofattore organico della vitamina A, chiamato retinale. In collaborazione con il gruppo del Prof. Sekler (Ben-Gurion University-Israel), abbiamo fuso una variante del classico ChR2, detta SSFO (Step stabilized function Opsin), con una sequenza di localizzazione mitocondriale, al fine di creare una canale controllato dalla luce in grado di depolarizzare i mitocondri in modo reversibile (4mt-SSFO). Infatti, le SSFOs sono varianti di ChR in grado di aprirsi, se eccitate con luce blu, e di chiudersi, dopo circa 30 minuti dall'attivazione. É possibile tuttavia accelerare la chiusura del canale utilizzando della luce rossa. Per creare un controllo non funzionante di questo 4mt-SSFO, è stata creata una forma tronca di ChR2(TR) mancante del sito legante il retinale. La localizzazione di SSFO alla membrana mitocondriale interna (IMM) è stato ottenuta fondendo al N-terminale del ChR quattro sequenze di indirizzamento mitocondriale derivate da quella presente nella subunità VIII della citocromo C ossidasi umana. Per verificare la corretta topologia della sonda, sono stati effettuati esperimenti in microscopia confocale, di elettrofisiologia e di fluorescenza sfruttando la variante del 4mtSSFO fusa ad una YFP. Utilizzando vari “quenchers” di fluorescenza e diverse proteasi (Trypan Blue, Proteinase K, Alamethicin) abbiamo dimostrato che il nuovo canale localizza correttamente in IMM con il C-terminale protetto nella matrice mitocondriale. Il secondo passo è stata la verifica della funzionalità dei nuovi costrutti 4mtSSFO-YFP in situ, verificando la loro capacità di modificare il potenziale di membrana mitocondriale in risposta alla luce. Confermata la funzionalità, abbiamo poi analizzato più in dettaglio l'effetto della depolarizzazione mitocondriale sulla capacità del mitocondrio di regolare l'ingresso di Ca2+, utilizzando due sonde geneticamente codificate, il 4mtD3cpv e l'aequorina indirizzata ai mitocondri. Entrambi gli approcci dimostrano che la depolarizzazione dei mitocondri, innescata dalla fotoattivazione del canale, induce, come atteso, una significativa riduzione dell’entrata del Ca2+ all'interno del mitocondrio. L'ingresso di Ca2+ in questo organello è stato indotto stimolando cellule HeLa con un agonista producente IP3. Concludendo, i dati ottenuti sino ad ora confermano la generazione di uno strumento molecolare in grado di modulare l'attività dei mitocondri con precisione temporale e in modo reversibile (almeno in linea di principio) e specifico, offrendo così un nuovo approccio per determinare quantitativamente il ruolo mitocondriale in una grande varietà di processi cellulari critici. Nella seconda parte della mia tesi, mi sono concentrata sullo studio del ruolo delle Preseniline nell'alterazione dell'omeostasi del Ca2+ nella malattia di Alzheimer (AD), utilizzando un approccio a singola cellula e concentrandomi sul ruolo delle mutazioni presenti in Presenilina 1 e Presenilina 2 correlate ad AD nella regolazione dell'ingresso capacitativo di calcio (CCE). AD è la forma più frequente di demenza. Una piccola percentuale di casi è ereditaria (Familial AD, FAD) ed è dovuta a mutazioni dominanti in tre geni, che codificano per la proteina precursore dell'amiloide (APP), Presenilina-1 (PS1) e presenilina-2 (PS2). Mutazioni in questi geni provocano alterazioni nel taglio di APP mediato da un enzima, detto complesso y-secretasico, che annovera tra i suoi componenti PS1 e PS2, e che è in grado di causare un aumento del rapporto tra Abeta42 e Abeta40, i due peptidi derivati dalla maturazione di APP. La generazione di tali peptidi, a sua volta, aumenterebbe la deposizione di placche amiloidi, una delle caratteristiche istopatologiche principali dell'AD. Ad oggi, la generazione dei peptidi Abeta42, dei suoi oligomeri e delle placche amiloidi, costituisce il cuore dell’ipotesi patogenetica più accreditata per AD, “l'ipotesi della cascata amiloide". PS1 e PS2 sono proteine omologhe e ubiquitarie formate da 9 domini trans-membrana. Esse sono localizzate prevalentemente nelle membrane interne di reticolo endoplasmatico (ER), apparato di Golgi, endosomi e nella membrana plasmatica (PM). Pur essendo il nucleo catalizzatore della y-secretasi, le PSs svolgono anche ruoli indipendenti dall'attività di questo enzima, tra cui la regolazione dell'omeostasi del Ca2+. Quest'ultimo fenomeno infatti risulta variamente alterato in presenza di mutazioni FAD nelle PSs. Il Ca2+ è un secondo messaggero intracellulare chiave nelle cellule viventi e regola una moltitudine di funzioni cellulari, pertanto alterazioni nelle sue vie di segnale possono essere dannose per il destino della cellula. Alterazioni nell'omeostasi del Ca2+ sono state proposte come meccanismo causale per diverse malattie neurodegenerative e in particolare per l'AD. Sebbene supportata da diversi lavori, l'ipotesi del Ca2+ per la patogenesi dell'AD è stata a lungo messa in discussione, a causa dello scarso consenso della comunità scientifica sull'effetto di mutazioni in PSs nella regolazione di questo ione. Uno dei meccanismi che sembra essere modulato da diverse mutazioni FAD associate a PSs, è il cosiddetto CCE, o Store Operated Calcium Entry (SOCE). Il CCE è il meccanismo responsabile dell'influsso di Ca2+ all'interno della cellula in risposta allo svuotamento dell'ER. Le molecole chiave responsabili del CCE sono state identificate solo di recente: STIM e Orai. Brevemente, Orai1 forma i canali situati in PM, mentre STIM1 è la proteina che "sente" la [Ca2+] nel lume dell'ER. Quando l'ER si svuota, STIM1 cambia la sua distribuzione diffusa, oligomerizza in punte (puncta) discrete che, a questo punto, sono in grado di interagire con Orai1 a livello della PM. Utilizzando una sonda citosolica Cameleon (D3cpV), ho valutato le variazione di CCE in cellule SH-SY5Y sovra-esprimenti PSs e in fibroblasti derivati da pazienti FAD o da controlli sani. In particolare, le mutazioni FAD, PS1-A246 e PS2-T122R (in sovra-espressione) e PS1-A246 e PS2-N141I (in fibroblasti) causano una diminuzione del CCE, sia della sua entità che della sua velocità di attivazione. Questo fenomeno può essere spiegato da un diminuito livello di STIM1 nei campioni FAD rispetto ai controlli, mentre non è stato possibile valutare i livelli proteici di Orai, poiché non è disponibile un anticorpo abbastanza specifico. Negli esperimenti di sovra-espressione, anche la forma wild type di PS1 e PS2 causa una diminuzione del CCE, fenomeno probabilmente dovuto all'accumulo della forma lunga (non tagliata) delle PSs, forma che sembra essere responsabile degli effetti mediati dalle PSs sull'omeostasi del Ca2+