Effetti metabolici in vitro degli inibitori delle deacetilasi istoniche su colture primarie di epatociti di ratto

L’acetilazione e la deacetilazione del DNA sono meccanismi epigenetici cruciali responsabili della regolazione della struttura della cromatina e della trascrizione del DNA, che consentono una maggiore o minore accessibilità ai fattori di trascrizione e alla RNA polimerasi, inducendo o inibendo rispettivamente l’espressione genica. In letteratura è descritto che gli inibitori della deacetilazione degli istoni (HDACIs = histone deacetylase inhibitors) possono influenzare il DNA inducendo la traduzione di geni tipicamente espressi nelle cellule del fegato ed il differenziamento di linee cellulari tumorali verso il pattern epatico, tuttavia sono ancora pochi i dati disponibili sui loro specifici effetti sugli epatociti. Epatociti di ratto Sprague-Dawley appena isolati sono stati seminati su piastre con substrato di matrigel e coltivati con medium di controllo o con medium contenente uno dei seguenti HDACIs: il sodio butirrato (NaBu, 500 nM), l’acido valproico (VPA, 2 mM) e la tricostatina A (TSA, 10 mM). Dopo 4 giorni sono stati determinati i seguenti parametri: la funzionalità del metabolismo epatico tramite l’analisi della secrezione di albumina (sandwich ELISA, normalizzando i dati per il contenuto proteico misurato con il metodo di Bradford tramite il Blu di Comassie), l’analisi dell’espressione genica di albumina (analisi di Real Time PCR, RT-PCR), la quantificazione della sintesi di urea (realizzata mediante metodo colorimetrico con il carico di ammoniaca), la stima della citotossicità (quantificazione del rilascio di latticodeidrogenasi [LDH] mediante spettrofotometria) e della proliferazione cellulare (incorporazione di bromodesossiuridina [BrDU] mediante microscopia a fluorescenza). La secrezione di albumina è risultata raddoppiata dopo l’esposizione degli epatociti al NaBu rispetto ai controlli (92.35 ± 18.97 ?g/mg proteine contro 44.36 ± 7.81 ?g/mg proteine; p = 0.02), mentre è stata inibita dal VPA (25.09 ± 3.02 ?g/mg proteine contro 44.36 ± 7.81 ?g/mg proteine; p = 0.03) e non è influenzata dal TSA (46.9 ± 9.12 ?g/mg proteine contro 44.36 ± 7.81 ?g/mg proteine; p = 0.83). L’analisi dell’espressione di albumina tramite RT-PCR conferma tali risultati (i dati sono espressi come valori relativi rispetto ai controlli i quali per convenzione hanno valore 1; VPA = 2.2; NaBu = 2.6; TSA = 1.8). Il metabolismo dell’urea è risultato inalterato (controlli = 25.47 ± 4.06 ?g/mg proteine/ora; VPA = 23.45 ± 4.87 ?g/mg proteine/ora, p = 0.75; NaBu = 30.53 ± 6.98 ?g/mg proteine/ora, p = 0.54; TSA = 25.89 ± 5.97 ?g/mg proteine/ora, p = 0.95). Le cellule sono risultate significativamente meno vitali se esposte al NaBu (54.26 %, p <0.001) ed al VPA (40.12 %, p = 0.0097) rispetto ai controlli (70.74%), mentre il TSA si è dimostrato meno citotossico (67.85 %, p = 0.56). La proliferazione degli epatociti è risultata incrementata nell’esposizione al VPA (19.82 ± 3.19 cellule BrDU-positive/mm2, p <0.01) mentre è diminuita con il NaBu (2.05 ± 0.84 cellule BrDU-positive/mm2) rispetto ai controlli (5.88 ± 0.70 cellule BrDU-positive/mm2, p <0.01). Il NaBu sembra quindi essere un agente di differenziazione per gli epatociti in grado di stimolare l’espressione genica dell’albumina e la sua secrezione. Tuttavia la sintesi di urea sembra non esserne influenzata. Il NaBu è risultato meno epatotossico del VPA, il quale costituisce peraltro un buono stimolo proliferativo. Il TSA gioca un ruolo quasi neutro ai dosaggi testati. Questi risultati suggeriscono di approfondire un possibile utilizzo degli HDACIs per incrementare le funzioni tipiche degli epatociti non solo in vitro ma anche nei dispositivi per il fegato bioartificiale.