Synthesis and use of rigid peptide scaffolds

Per comprendere in dettaglio sistemi naturali molto complicati, con diverse relazioni inter- ed intramolecolari, oppure per creare nuovi nanosistemi con proprietà quali il riconoscimento molecolare o la conservazione di informazioni è necessario poter progettare e sintetizzare molecole modello di complessità ridotta nonchè una struttura tridimensionale ben definita. In questa Tesi di Dottorato è stato deciso di applicare la capacità degli α-amminoacidi CPαP-tetrasostituiti di formare strutture 3B10B-elicoidali particolarmente stabili, al fine di disporre di peptidi rigidi utili per studi di tipo spettroscopico, conformazionale e per applicazioni in sintesi organica. 1. Nuovi tipi di spettroscopie e sistemi peptidici rigidi A) 2D IR. La spettroscopia di assorbimento infrarosso a due dimensioni (2D IR), insieme alla marcatura isotopica hanno permesso di rivelare gli accoppiamenti vibrazionali esistenti tra i modi ammide-I e ammide-II di residui distanti tra loro ma direttamente connessi attraverso un legame a idrogeno. Questa strategia è stata dimostrata su un peptide elicoidale di tipo 310 ed i suoi isotopomeri marcati con 13C, 18O e 15N. Grazie ai picchi fuori diagonale, riconoscibili dalla marcatura isotopica, si è dimostrato che i modi ammide I e II del secondo e quarto legame peptidico sono accoppiati vibrazionalmente, in quanto formano un ripiegamento elicoidale stabile di tipo 310. Con questo studio si è messo in evidenza che il 2D IR unito ad una opportuna marcatura isotopica può essere un metodo utile per ottenere informazioni strutturali già a livello di singolo residuo (in collaborazione con il gruppo della prof.ssa N.-H. Ge, University of California, Irvine). B) VCD. Gli accoppiamenti che si instaurano tra legami ammidici sono alla base della capacità della spettroscopia di assorbimento FT-IR o del dicroismo circolare elettronico di distinguere tra varie strutture secondarie di peptidi o proteine. Grazie all’uso della marcatura sito-specifica mediante 13C, si è potuto isolare la banda dell’ammide I in spettri di esa- ed ottapeptidi aventi conformazione elicoidale di tipo 310. Frequenza ed intensità di tali assorbimenti sono state misurate attraverso spettroscopia Raman, assorbimento FT-IR e VCD e successivamente simulate con calcoli DFT. Le costanti di accoppiamento sono state ottenute grazie al fitting dei componenti delle bande spettrali. L’accoppiamento sequenziale ottenuto per eliche di tipo 310 è più debole di quello nelle α-eliche, ma maggiore di quello ottenuto per la poli-(Pro)n di tipo II (in collaborazione con il gruppo del prof. T.A. Keiderling, University of Illinois, Chicago). 2. Cα-metilprolina: un particolare caso di doppia personalità La Cα-metilprolina è uno degli α-ammino acidi conformazionalmente più ingombrati. In questo lavoro si sono esaminate le preferenze conformazionali di un vasto numero di Nα-acil dipeptidi N'-alchilammidi del tipo RCO-(αMe)Pro-Xxx-NHR' o RCO-Xxx-(αMe)Pro-NHR' (con Xxx = L (o D)-Ala, Aib, oppure L (o D)-(αMe)Pro) sufficentemente lunghi per dare ripiegamenti di tipo γ o β stabilizzati da legami a idrogeno intramolecolari. I risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli dei corrispondenti dipeptidi basati sulla Pro, residuo che notoriamente tende a dare tali ripiegamenti. Mediante le spettroscopie di assorbimento FT-IR, 1H e 13C NMR nonchè la diffrazione ai raggi X è stata condotta un’analisi strutturale dettagliata, grazie alla quale si desume che l’(αMe)Pro è in grado di esplorare entrambe le zone trans' e cis' dello spazio conformazionale. Tuttavia, quest’ultima zona è considerevolmente più popolata nel caso dell’(αMe)Pro, in netto contrasto con quanto accade per la Pro. Questo fatto è una indicazione piuttosto chiara del fatto che nell’(αMe)Pro è il metile sul Cα a dirigere le preferenze conformazionali di questo α-ammino acido. In base a tali risultati è stato proposto l’andamento caratteristico dello spettro ECD per un ripiegamento β di tipo III'. 3. Macrociclizzazioni su eliche peptidiche In seguito al periodo trascorso in qualità di visiting student presso il gruppo di ricerca dei proff. R.H. Grubbs e D.J. O’Leary (California Institute of Technology e Pomona College, rispettivamente) si è voluto esplorare l’uso della reazione di metatesi olefinica nella costruzione del primo fascio bis-peptidico 310-elicoidale (ladder peptide). In questo capitolo viene riportata la sintesi ed alcune prime indagini conformazionali di questo macrociclo peptidico ricco di residui di Aib. Nella prima parte del lavoro si è valutata la possibilità di inserire un’unità allilica in catena laterale di un α-ammino acido senza problemi di racemizzazione. Dopo vari tentativi, è stato scelto Asp come α-ammino acido avente funzione di linker nella preparazione del fascio peptidico. La sintesi del ladder è proseguita con metodi in soluzione e il macrociclo ottenuto attraverso RCM è stato sottoposto a una prima analisi conformazionale in soluzione mediante assorbimento FT-IR, spettroscopia NMR e ECD. I risultati sinora ottenuti indicano che questo peptide tende ad assumere una conformazione elicoidale di tipo 310 in soluzione, confermando quanto atteso per sequenze peptidiche ricche di Aib. Dall’analisi NMR, inoltre, si evince la presenza di un equilibrio tra due conformeri maggioritari in soluzione di DMSO. Nonostante siano necessari ulteriori dati per confermare tale ipotesi, si è tentato di spiegare tale effetto mediante l’instaurarsi di una rotazione reciproca tra le due eliche peptidiche.