Effects of snake neurotoxins and lipids on neurons

Il veleno di molti serpenti contiene neurotossine ad azione presinaptica (SPAN, snake presynaptic PLA2 neurotoxin) che sono in grado di provocare blocco della neurotrasmissione e paralisi muscolare. I motivi strutturali sono molto conservati, ma la struttura quaternaria è molto variabile; si sono perciò prese in considerazione quattro tossine di diversa complessità strutturale: notexin (monomero), ?-bungarotoxin (eterodimero), taipoxin (trimero) e textilotoxin (pentamero). Queste tossine sono dotate di attività enzimatica di tipo PLA2, cioè idrolizzano il legame estereo in posizione 2 dei glicerofosfolipidi, producendo lisofosfolipidi e acidi grassi. Utilizzando miscele equimolari di questi lipidi su giunzione neuromuscolare isolata e su neuroni in coltura si è dimostrato che essi sono in grado di riprodurre gli effetti delle tossine: blocco della neurotrasmissione con alterazione della morfologia dei terminali (deplezione delle vescicole sinaptiche, rigonfiamento, alterazione dei mitocondri) e formazione di rigonfiamenti (“bulges”) sui neuriti, caratterizzati da accumulo di proteine specifiche delle vescicole sinaptiche. Questi dati hanno portato a interpretare il meccanismo d’azione delle tossine come uno sbilanciamento tra eso ed endocitosi, dovuto alle caratteristiche strutturali dei lipidi che vengono prodotti: la lisofosfatidilcolina (lisoPC) ha forma di cono invertito e rimane confinata nel foglietto esterno della membrana, gli acidi grassi hanno forma a cono, ma si ripartiscono velocemente su entrambe i foglietti. Questa alterazione della composizione lipidica della membrana plasmatica ne provoca una deformazione che rende più facile il processo di fusione con le vescicole sinaptiche, cioè facilita la transizione tra intermedio di emifusione e poro aperto; per le stesse ragioni invece inibisce l’endocitosi, necessaria per il recupero delle vescicole stesse e il mantenimento della funzionalità della sinapsi. Analoghi risultati di blocco della neurotrasmissione sono stati ottenuti testando lisofosfolipidi con diverse teste polari; in particolare, lisolipidi dotati di carica negativa, in presenza di alte concentrazioni di magnesio, sono in grado di provocare un andamento trifasico della paralisi (iniziale depressione, facilitazione, diminuzione progressiva della contrazione muscolare) ritenuto tipico delle SPANs. Il fenomeno è reversibile mediante lavaggio con albumina, capace di complessare i lipidi e riequilibrare la situazione. Le SPANs e i loro prodotti lipidici sono stati testati anche sulla giunzione neuromuscolare di Drosophila melanogaster: le tossine sono risultate inattive in questo modello, suggerendo la mancanza di recettori specifici, necessari alla loro azione. La miscela di lisoPC e acido oleico provoca invece un iniziale aumento del potenziale post-sinaptico eccitatorio, seguito dal blocco della neurotrasmissione, e un rigonfiamento dei bottoni sinaptici. Analogamente a quanto osservato sulla giunzione neuromuscolare di topo, il componente attivo è la lisoPC e il suo effetto sulla fusione delle vescicole sinaptiche sembra essere di carattere generale. Anche animali meno evoluti dei serpenti, come alcuni insetti ematofagi, contengono nella loro saliva concentrazioni significative di lisoPC, sufficienti a provocare nei modelli sperimentali effetti analoghi a quelli osservati con i lipidi sintetici. E’ possibile che questi lipidi rappresentino una forma molto semplice di veleno ottenuto da fosfolipasi digestive, da cui si sono in seguito evolute le neurotossine. L’effetto sulla fusione delle vescicole non è sufficiente a spiegare l’estensiva deplezione che si osserva dopo l’intossicazione. La prolungata produzione di lisolipidi e acidi grassi provoca un’alterazione della permeabilità della membrana allo ione calcio, che entra nella cellula principalmente dal mezzo esterno. Questo comporta una massiccia fusione delle vescicole sinaptiche, che coinvolge anche il pool di riserva, e alterazioni del metabolismo cellulare, soprattutto a carico dei mitocondri. Tossine coniugate con fluorofori sono visibili all’interno dei neuroni dopo tempi brevi di intossicazione e colocalizzano con i mitocondri. Su preparazioni di mitocondri isolati sono in grado di promuovere l’apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale con un’efficienza proporzionale alla loro attività fosfolipasica; analoghi risultati si sono ottenuti con miscele di lisoPC e acidi grassi. Blocco reversibile della neurotrasmissione, formazione di bulges nei neuroni e aumento dei livelli intracellulari di calcio sono prodotti, con cinetiche simili a quelle della lisoPC, anche da altre molecole anfipatiche di diversa struttura chimica, ma aventi una forma complessiva di cono invertito. Tra queste sono state testate miltefosina e perifosina, usate in terapia come agenti anti-tumorali, e il lisolipide derivato dal PAF (Platelet Activated Factor). La neurotossicità delle fosfolipasi di serpente deriva quindi da una elevata specificità e localizzazione dell’attività enzimatica; accanto a ciò è da considerare che la loro azione si esplica su un meccanismo che ha carattere più generale, cioè il ruolo dei lipidi nei processi di fusione delle membrane biologiche.