Zebrafish as a model for dissecting the in vivo roles of Collagen VI

ll mio progetto di dottorato si è basato sull'utilizzo del modello animale Danio rerio (zebrafish) al fine di analizzare l'espressione e la funzione del collagene VI (COL6), un componente chiave della matrice extracellulare presente in vari tessuti e coinvolto in numerosi processi fisiologici e patologici. Mutazioni a carico dei geni codificanti per le catene del COL6 sono note causare diverse forme di malattie muscolari ereditarie nell'uomo, tra cui la miopatia di Bethlem e la distrofia muscolare congenita di Ullrich. Diversi modelli animali sono stati generati al fine di studiare queste miopatie. In particolare, gli studi condotti su topi knockout per il COL6 (Col6a1–/–) hanno permesso di mettere in luce alcuni dei ruoli chiave che questa proteina esercita in vivo. Tali lavori hanno infatti dimostrato che il COL6 svolge importanti funzioni citoprotettive, che vanno dal contrastare l'apoptosi e i danni ossidativi alla regolazione del differenziamento e dell'autofagia. Ciò nonostante, nessuno studio ha finora mai indagato a fondo quali siano le funzioni del COL6 durante lo sviluppo embrionale e nella regolazione delle vie di segnalazione intracellulari. Pertanto, allo scopo di ottenere ulteriori conoscenze su questi aspetti, abbiamo deciso di utilizzare lo zebrafish, un modello ampiamente impiegato negli studi sullo sviluppo dei vertebrati e sulla funzione genica. Grazie infatti alla sua trasparenza e al suo rapido sviluppo, lo zebrafish rappresenta un ottimo modello per visualizzare il pattern di espressione di un gene nell'intero organismo. Inoltre, la disponibilità di numerose linee transgeniche reporter rende lo zebrafish uno strumento ideale per lo studio in vivo delle vie di segnalazione intracellulare. Durante la prima parte del mio lavoro di dottorato, ho analizzato in dettaglio il pattern di espressione spazio-temporale e la distribuzione delle diverse catene del COL6 in embrioni, larve e adulti di zebrafish. I dati ottenuti dimostrano che i geni COL6 presentano un pattern di espressione nello zebrafish molto simile a quella dei rispettivi ortologhi in mammifero. In particolare, sfruttando un nuovo anticorpo che riconosce in maniera specifica il COL6 di zebrafish, ho potuto caratterizzare in dettaglio la distribuzione della proteina in questo organismo, sia durante lo sviluppo embrionale che in età adulta. Tali dati sono di notevole interesse, in quanto forniscono una base essenziale per poter effettuare degli studi funzionali in questo modello animale. I risultati ottenuti sono stati quindi raccolti in un lavoro intitolato "Spatio-temporal expression and distribution of collagen VI during zebrafish development", il quale è attualmente in fase di revisione. Nella seconda parte del mio dottorato ho svolto studi funzionali sfruttando una nuova linea di zebrafish priva di COL6, generata nel laboratorio attraverso la tecnologia di mutagenesi sito-specifica CRISPR/Cas9. In tale linea ho individuato numerosi difetti neuromuscolari e peculiari alterazioni nella struttura tridimensionale delle cartilagini craniofacciali. Inoltre, ho identificato che l’assenza di COL6 causa alterazioni nella via di segnale di Wnt, suggerendo un ruolo del COL6 nel regolare questa via di segnalazione intracellulare. Complessivamente, i dati ottenuti dimostrano che la linea di zebrafish non esprimente il COL6 rappresenta un valido modello in vivo per svelare connessioni ancora poco conosciute tra carenza di COL6 e deficit molecolari e di vie di segnalazione. Le evidenze riportate in questa tesi sottolineano infatti come lo zebrafish sia estremamente utile nello studio del ruolo di questa proteina di matrice in diversi contesti fisiologici e patologici, sia durante lo sviluppo che nella vita adulta. Inoltre, il modello zebrafish COL6 knockout rappresenta lo strumento ideale per effettuare studi farmacologici volti ad identificare nuovi trattamenti per le malattie associate ad alterazioni del COL6.