Ammino Ossidasi umana sensibile alla semicarbazide: dalla caratterizzazione cinetica agli studi cellulari in adipociti.

L’ammino ossidasi umana sensibile alla semicarbazide (SSAO/VAP-1) è una glicoproteina transmembrana, che catalizza la deamminazione ossidativa di ammine primarie ad aldeidi, con rilascio dello ione ammonio e perossido di idrogeno. Il suo ruolo fisiologico non è ancora chiaro: in adipociti, l’attività SSAO/VAP-1 ha un effetto che mima quello dell’insulina, mentre nell’endotelio vascolare e sinusoidale epatico, SSAO/VAP-1 è coinvolta nell’extravasazione dei leucociti ai siti di infiammazione. Su queste basi, lo sviluppo di nuovi specifici inibitori per SSAO/VAP-1 è un target importante per lo sviluppo di nuovi farmaci antinfiammatori, mentre lo sviluppo di nuovi specifici substrati può contribuire a chiarire le funzioni fisio-patologiche di questo enzima. Per ottenere informazioni sulle caratteristiche che una molecola dovrebbe possedere per essere riconosciuta dal sito attivo dell’enzima umano SSAO, è stata eseguita una caratterizzazione cinetica di SSAO/VAP-1 da adipociti, utilizzando ammine primarie, caratterizzate da differente lunghezza, ingombro sterico e distribuzione di carica. L’1,12 diamminododecano e la cis-4-cloro-butenilammina sono risultati i substrati con la più alta efficienza catalitica fra quelli provati. E’ stato possibile stimare il valore di costante dielettrica del sito attivo di SSAO/VAP-1, che è compreso in un intervallo di circa 10-20. Dall’effetto del pH sul rapporto Vmax/KM della SSAO/VAP-1 per alcuni substrati, è stato possibile evidenziare che un residuo nella sua forma protonata inibisce la catalisi. Da un’analisi preliminare delle strutture 3D di VAP-1, questo residuo potrebbe essere la lisina 393. Dall’effetto della forza ionica e della temperatura sull’attività enzimatica è stato possibile dedurre che l’effetto idrofobico sembra avere un ruolo importante nella fase di riconoscimento substrato - sito attivo della SSAO/VAP-1. Sono state anche provate varie classi di composti (sali di fosfonio ed ammonio, piridina, anilina e i suoi derivati e gli N-ossidi), che sebbene siano buoni inibitori per l’enzima da siero bovino, si sono rivelati inibitori poco efficienti per l’enzima umano SSAO/VAP-1 (valori minimi di Ki=3-4 mM), anche se l’omologia di sequenza fra i due enzimi è elevata (82%). Dall’insieme di questi studi, è emerso che un buon substrato o inibitore per l’enzima umano SSAO/VAP-1 dovrebbe essere una molecola caratterizzata da una larga porzione apolare e dalla presenza di una carica positiva ad una distanza maggiore di 10-12 ? dal gruppo amminico reattivo. Per ovviare all’impiego di isotopi radioattivi, è stato messo a punto un metodo fluorimetrico discontinuo per la misura dell’attività di SSAO/VAP-1 nel plasma umano. Il metodo è stato validato e applicato alla misura dell’attività della forma solubile di SSAO/VAP-1 nel plasma umano di individui controllo e in pazienti affetti da diverse patologie. Un aumento significativo dei livelli di attività SSAO/VAP-1 plasmatica è stato trovato in pazienti con Alzheimer “moderato-grave” ed in pazienti con impianto di stent coronarico. In questi pazienti oltre a SSAO/VAP-1, è stato trovato inoltre un aumento dei livelli di attività della superossido dismutasi circolante nel plasma, suggerendo una condizione di “stress ossidativo”, probabilmente dovuta alla presenza dello stent. Nel caso dei pazienti con cirrosi epatica esotossica (indotta da abuso di alcool), è stato messo in luce un aumento dell’attività della forma solubile si SSAO/VAP-1 nei pazienti con cirrosi epatica “lieve-moderata” (classificazione Child), mentre nei pazienti con cirrosi epatica “grave”, questo aumento si riduce. I risultati ottenuti suggeriscono che elevati livelli della forma solubile di SSAO/VAP-1, sono la conseguenza di un’intensa risposta infiammatoria, mentre la relativa diminuzione del livello di SSAO/VAP-1 nello stato più grave della patologia, potrebbe essere dovuto ad un crollo delle difese immunitarie in questi pazienti. Per cercare di chiarire un possibile ruolo dell’attività di SSAO/VAP-1 negli adipociti, è stato condotto uno studio preliminare trattando le cellule con fattori quali insulina, metilammina, catalasi e malvidina 3-glucoside. L’analisi SDS-PAGE, evidenzia che alcune proteine sono espresse in maniera differente nell’incubazione degli adipociti con questi fattori. In particolare, la presenza di questi composti modula l’espressione di SSAO/VAP-1 e delle MAO, suggerendo che entrambi gli enzimi sono coinvolti in una comune via di segnale, mediata dall’insulina. In futuro l’identificazione delle proteine espresse tramite Spettrometria di Massa, associata ad analisi tramite Immunoblotting con anticorpi specifici, potrà contribuire a chiarire il collegamento tra SSAO/VAP-1 e la via di segnale mediata dall’insulina e a dare nuove informazioni sul ruolo di questo enzima.