MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERISATION OF INFLAMMATORY RESPONSES IN MILD TO SEVERE CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE (COPD): IDENTIFICATION OF AUTOIMMUNE STIGMATA

INTRODUZIONE La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è una delle patologie responsabili del maggior numero di morti a livello mondiale. Clinicamente la BPCO si presenta come una limitazione del flusso respiratorio non completamente reversibile, associata ad una anomala risposta infiammatoria che caratterizza le piccole vie aeree e le strutture alveolari. A livello di tali distretti si riscontrano infatti un importante infiltrato cellulare infiammatorio e un rimodellamento architetturale che prevede un ispessimento delle pareti delle vie aeree periferiche, con conseguente riduzione del diametro e aumentata resistenza al flusso aereo. Inizialmente la patogenesi della BPCO si fondava sullo sbilanciamento del rapporto proteasi/antiproteasi, ma la visione attuale attribuisce un ruolo chiave alla risposta immunitaria acquisita, in particolare ai linfociti T. Infatti, la risposta infiammatoria mediata da tale tipo cellulare a gas e polveri inalati rappresenta un punto cruciale nello sviluppo della BPCO. Recentemente è stata ipotizzata un’origine autoimmune di tale patologia. Studi clinici e sperimentali si stanno focalizzando nello studio dei complessi meccanismi immunologici alla base della malattia. SCOPO DELLA RICERCA Il principale obiettivo di questa ricerca è stato quello di caratterizzare da un punto di vista morfologico e molecolare la risposta infiammatoria in pazienti con diversi gradi di BPCO (GOLD I-IV) al fine di identificare segni tissutali di autoimmunità. In particolare, nel parenchima polmonare di pazienti con diversi gradi di BPCO, è stato caratterizzato l’infiltrato cellulare infiammatorio ed è stata valutata l’espressione dei mediatori pro-infiammatori interleuchina-IL-32 e fattore di necrosi tumorale-TNF-α. In alcuni pazienti con BPCO è stato effettuato lo studio della cellularità e dell’espressione di IL-32 nell’espettorato indotto. Tutti i dati morfologici e molecolari sono stati correlati ai parametri clinici e funzionali. MATERIALI E METODI La ricerca è stata condotta fondamentalmente in tre fasi. La prima fase della ricerca ha previsto lo studio di 40 pazienti con BPCO in stadio IV, confrontandoli con i gruppi di controllo, costituiti da fumatori con funzionalità respiratoria normale (n=11) e non fumatori (i campioni tissutali sono stati ottenuti da polmoni non impiantati di donatori) (n=9). In tutti i pazienti e i controlli, l’infiltrato cellulare infiammatorio è stato caratterizzato mediante immunoistochimica per CD20, CD45RO, CD4, CD8, CD3 e CD68. In particolare, è stato valutato il numero di aggregati follicolari di linfomonociti in sezioni dopo immunoistochimica per CD20, essendo tali follicoli prevalentemente costituiti da linfociti B. Dopo dissezione manuale di follicoli CD20 positivi, è stato estratto il DNA ed è stata valutata la clonalità della popolazione linfocitaria di tipo B mediante analisi della catena pesante delle immunoglobuline (IgH). La seconda fase della ricerca è stata condotta nei campioni tissutali di 40 pazienti con diversi stadi di BPCO e nei gruppi di controllo descritti precedentemente. In particolare, è stata valutata l’espressione di IL-32 and TNF-α mediante immunoistochimica, microscopia confocale e reazione a catena della polimerasi. Nella terza fase della ricerca ci si è focalizzati sullo studio immunocitochimico e molecolare dell’espressione di IL-32 nell’espettorato indotto di 36 pazienti, 16 fumatori con diagnosi di BPCO, 14 fumatori con funzionalità respiratoria normale e 6 non fumatori. RISULTATI Prima fase della ricerca: tutti i campioni tissutali di pazienti con BPCO presentavano estese alterazioni enfisematose ed un importante infiltrato infiammatorio. E’ stato riscontrato un aumentato numero di cellule infiammatorie (CD20+, CD3+, CD8+, CD68+, CD45RO+, CD4+), soprattutto di cellule CD45RO, CD3 e CD8 positive, nei pazienti con BPCO rispetto ai soggetti di controllo. I follicoli linfoidi erano quasi assenti nei polmoni senza alterazioni istologiche di rilievo dei donatori ma sono stati frequentemente riscontrati nei BPCO molto gravi (stadio IV). I linfociti B (cellule CD20 positive) erano il principale tipo cellulare presente in tali follicoli. In particolare, il numero di follicoli linfoidi risultava aumentato nei pazienti con BPCO da deficit di α1-antitripsina rispetto ai pazienti senza deficit. L’analisi molecolare delle IgH ha mostrato un’origine mono/oligoclonale di tali follicoli. Seconda fase della ricerca: è emerso un aumento della percentuale di macrofagi IL-32 positivi nei pazienti con BPCO rispetto ai controlli fumatori e non fumatori. Inoltre, tale percentuale risultava aumentata nei fumatori con funzionalità respiratoria normale rispetto ai non fumatori. Le indagini immunoistochimica e di microscopia confocale hanno dimostrato una coespressione di IL-32 e TNF-α. La reazione a catena della polimerasi ha confermato i dati immunoistochimici e mostrato che l’mRNA di IL-32 corrispondeva alle isoforme non-α (β, γ, δ e ε). L’isoforma α è stata riscontrata nel 54% dei soggetti di controllo (7/13) e solo nel 6% dei pazienti con BPCO (1/17). Terza fase della ricerca: si è notata una maggiore cellularità totale nell’espettorato indotto dei pazienti con BPCO rispetto ai gruppi di controllo. In particolare, i pazienti con BPCO presentavano un minor numero di macrofagi e un aumentato numero di neutrofili e linfociti. L’espressione di IL-32 e il tipo di isoforme rilevate non sono risultati differenti nei tre gruppi: l’amplificato corrispondente all’isoforma β era visibile in tutti i casi, mentre l’isoforma ε nel 54% dei pazienti con BPCO, nel 27% dei fumatori di controllo e nel 50% dei non fumatori. CONCLUSIONI I nostri principali risultati confermano il ruolo chiave della risposta immunitaria nella patogenesi della BPCO, in quanto preponderante in ogni stadio e forma della patologia. La risposta immunitaria acquisita, costituita da linfociti T e B, è una componente chiave nella progressione della malattia, vista la persistenza anche nelle forme end-stage di BPCO. Di particolare interesse è stato il riscontro di linfociti B aggregati in follicoli linfoidi nella BPCO, risultanti da un processo di selezione oligoclonale come occorre in altre malattie autoimmuni (es. sindrome di Sjogren). Le citochine proinfiammatorie IL-32 e TNF-α sono risultate notevolmente espressi in tutti gli stadi e forme della BPCO e correlavano direttamente con la severità del grado di infiammazione, così come è stato riscontrato in altre patologie autoimmuni (es. artrite reumatoide). In conclusione, nel nostro studio sono state riscontrati segni tissutali di autoimmunità, che corroborano la nuova ipotesi patogenetica della BPCO.