Regolazione della tirosin-fosforilazione della proteina Banda 3 Eritrocitaria

Negli eritrociti umani la tirosin chinasi Syk è un enzima chiave nella tirosin fosforilazione della proteina di membrana banda 3. Questo enzima, chiamato anche p72Syk, va incontro ad una significante proteolisi in assenza di inibitori proteasici, portando alla formazione di p36Syk, capace di indurre con maggiore efficienza la tirosin fosforilazione della banda 3 rispetto al p72Syk. Inoltre, la fosforilazione innescata dal p36Syk prepara le membrane per la successiva fosforilazione da parte dell’oloenzima p72Syk. Infatti quando le membrane sono pre-fosforilate con p36Syk, la successiva fosforilazione catalizzata dal p72Syk è maggiore rispetto a quella ottenuta in assenza della pre-fosforilazione. Poiché gli enzimi proteolitici sono presenti nelle membrane isolate e il p72Syk si lega al citoscheletro della cellula, probabilmente al dominio transmembrana della banda 3 ancorata a questa frazione della membrana, questo legame potrebbe permettere l’attivazione dell’enzima p72Syk attraverso la sua proteolisi. Negli eritrociti umani il livello di tirosin fosforilazione delle proteine, soprattutto della proteina transmembrana banda 3, è strettamente controllato dall’attività antitetica delle protein tirosin chinasi e fosfatasi, risultando in condizioni basali in uno stato di quasi completa defosforilazione. Solo stimoli particolari, come agenti ossidanti, diamide o pervanadato, o composti alchilanti, N-etilen maleimide (NEM), possono innescare la tirosin fosforilazione della banda 3, dovuta l’inibizione delle tirosin fosfatasi. SHP-1 è una protein tirosin fosfatasi contenente due domini SH2 espressa nelle cellule ematopoietiche. Noi dimostriamo che, negli eritrociti umani, SHP-1 è presente nelle membrane delle cellule in condizioni basali, ma solo il 5% della quantità totale dell’enzima. Questa percentuale incrementa fino a tre volte dopo il trattamento della cellula con NEM, mentre diamide e pervanadato, pur inducendo la tirosin fosforilazione della banda 3, non alterano la localizzazione basale dell’enzima. Ciò indica che la traslocazione della SHP-1 dal citoplasma alle membrane non dipende dalla tirosin fosforilazione della banda 3. Abbiamo dimostrato che la banda 3 è un substrato per l’enzima e che esso defosforila i residui tirosinici 8, 21 e 904 della proteina. Dal citoplasma del globulo rosso abbiamo purificato un’enzima con attività fosfatasica su para-nitro fenilfosfato (pNPP) attraverso una cromatografia a scambio ionico su DEAE-Sepharose, seguita da una gel filtrazione su una colonna G-75 Sephadex. La caratterizzazione dell’enzima purificato ha portato alla sua identificazione con la fosfatasi acida a basso peso molecolare. Tale identificazione è stata confermata dal western blotting, seguito dalla immunorivelazione con l’anticorpo appropriato. La fosfatasi acida a basso peso molecolare purificata è in grado di defosforilare i quattro siti fosfo tirosinici della banda 3: 8, 21, 359 e 904. In questo modo si è ottenuta per la prima volta la totale defosforilazione della proteina. Dapsone è un farmaco utilizzato nel trattamento della lebbra, malaria o pneumonia dovuta a Pneumocystis associata all’ AIDS. La sua N-idrossilazione porta alla formazione di idrossilamine tossiche responsabili della metaemoglobinemia associata al trattamento con dapsone. Inoltre, il farmaco è stato correlato alla riduzione della vita media dell’eritrocita, ottenendo come risultato conseguenze cliniche come anemia e morbidità nelle aree dove il dapsone è utilizzato per trattare la malaria. Noi abbiamo studiato il processo attraverso il quale il dapsone ed il suo metabolita idrossilamindapsome (DDS-NHOH) inducono alterazioni a livello della membrana eritrocitaria che portano alla rimozione prematura dell’eritrocita. I risultati indicano che DDS-NHOH, ma non il dapsone, è capace di innescare la tirosin fosforilazione delle proteine di membrana, soprattutto della banda 3. L’indotta tirosin fosforilazione raggiunge un massimo in 30’ di trattamento (con 0.3 mM) poi essa comincia a calare e dopo 45’ dall’inizio del processo sparisce completamente. Il reclutamento alla membrana degli enzimi coinvolti in questo processo, Syk e SHP-2, avviene in maniera dose e tempo dipendente, per entrambi gli enzimi. Inoltre la tirosin fosforilazione della banda 3 non è dovuta ad uno sbilanciamento tra le attività enzimatiche, dal momento che sia l’attività tirosin chinasica che quella tirosin fosfatasica sono inibite dal DDS-NHOH in maniera dose e tempo dipendente, ma più probabilmente è dovuta ad una favorevole interazione substrato-chinasi. Le modifiche che avvengono nella membrana indotte da DDS-NHOH continuano anche dopo che la la fosforilazione è annulata (dopo 45’) e portano all’aggregazione della banda 3. La localizzazione degli aggregati ad alto peso molecolare di banda 3 (HMWA) nei primi 30’ di incubazione è prevalentemente nella frazione solubile in Triton X-100. Con il prolungamento del tempo d’incubazione si ha non solo l’ulteriore incremento della quantità di aggregati, ma anche un loro definitivo spostamento nel citoscheletro della membrana eritrocitaria. Questo è un indizio di una completa riorganizzazione della membrana. L’analisi delle membrane ottenute da eritrociti incubati con concentrazioni crescenti di DDS-NHOH a vari tempi d’incubazione in presenza del plasma autologo ha rivelato un netto aumento nel contenuto di anticorpi autologhi. Poiché la rimozione dell’eritrocita è mediata dal riconoscimento da parte dei macrofagi degli anticorpi autologhi, la presenza di quest’ultimi sulla membrana del globulo rosso trattato con DDS-NHOH spiega la riduzione della vita media degli eritrociti nei pazienti trattati con dapsone.