PRESENILIN-2 AND CALCIUM HANDLING IN FAMILIAL ALZHEIMER'S DISEASE: A GENETICALLY ENCODED Ca2+ PROBES-BASED STUDY ROLE OF PS2 STRUCTURE, ER Ca2+-LEAK PATHWAYS AND ER-MITOCHONDRIA INTERPLAY

Il calcio (Ca2+) è un secondo messaggero chiave nelle cellule e regola una moltitudine di funzioni cellulari; questo significa che una dis-regolazione nella sua cascata di trasduzione del segnale può essere deleteria per il destino della cellula. Difetti nella regolazione del Ca2+ sono stati proposti come possibili cause della maggior parte delle malattie neurodegenerative e in particolare della Malattia di Alzheimer (AD). Sin dalla metà degli anni ’80 furono notate alterazioni nelle dimamiche intracellulari del Ca2+ in fibroblasti ottenuti da pazienti affetti da AD, ma studi sistematici sulla relazione tra AD e omeostasi del Ca2+ cominciarono solo dopo l’identificazione di mutazioni legate alle forme familiari di AD (FAD) a carico di tre geni, app, psen-1 e psen-2, codificanti per la Proteina Precursone dell’Amiloide (APP), Presenilina-1 e Presenilina-2 (PS1, PS2). Mutazioni in questi geni causano alterazioni nel taglio di APP ad opera di un enzima contenente PS1 o PS2, le quali comportano quindi un aumento nel rapporto tra i due principali peptidi derivanti dalla maturazione di APP, chiamati Ab40 e Ab42, in favore di quest’ultimo, la specie più tossica e con maggiore tendenza all’aggregazione; questo d’altra parte aumenta la deposizioni delle “Placche Amiloidi”, una delle caratteristiche istopatologiche dell’AD. Attualmente, la generazione dei peptidi Ab42, dei suoi oligomeri e infine delle placche amiloidi è alla base della principale ipostesi sulla patogenesi dell’AD, l’“Amyloid Cascade Hypothesis”. Riguardo l’omeostasi del Ca2+, la maggior parte dell’attenzione è stata rivolta all’effetto delle mutazioni in PS1 (e solo successivamente in PS2). Inizialmente la maggior parte dei lavori riportava un incremento degli aumenti citosolici di Ca2+ indotti dalla stimolazione del rilascio dal reticolo endoplasmatico (ER) in cellule esprimenti mutazioni in PS1 associate a FAD (FAD-PS1), e perciò suggerivano un aumento nel contenuto di Ca2+ del ER, “Ca2+ Overload Hypothesis”. Nonostante sia stata sostenuta da molti gruppi per diversi anni questa ipotesi non è mai stata indiscutibilmente accettata, poiché esistevano alcuni dati evidentemente in contrasto con essa, soprattutto considerando mutazioni a carico di PS2. Recentemente l’ipotesi del “Ca2+ Overload” ha ricevuto forte supporto dalla dimostrazione che le PS nella loro forma wild type (wt) formano canali a bassa conduttanza per il Ca2+ nella membrana del ER, rappresentando la maggior parte della via di fuga (leak) costitutiva del Ca2+ dallo stesso organulo; questa funzione sarebbe compromessa dalle mutazioni associate a FAD, che quindi porterebbero ad un sovraccarico di Ca2+ nel ER. Anche in questo caso, questi dati non sono stati universalmente accettati e altri gruppi hanno fornito spiegazioni alternative all’aumentato rilascio di Ca2+ nelle cellule esprimenti mutazioni associate a FAD a carico delle PS (soprattutto PS1), cioè un’aumentata attivazione del Recettore Rianodinico (RyR), una maggiore probabilità di apertura del Recettore dell’IP3 (IP3R) o un potenziamento dell’attività della Ca2+-ATPasi del ER (SERCA). È interessante osservate che alcuni di questi dati non riportano più un aumento nel contenuto di Ca2+ del ER (cioè quello che è propriamente definito “Ca2+ Overload”) ma piuttosto un rilascio esagerato di Ca2+ dallo stesso deposito, con una concentrazione al suo interno inalterata o persino diminuita. L’effetto delle mutazioni in PS2 è stato meno studiato ed è più dibattuto. Fibroblasti ottenuti da pazienti affetti da mutazioni FAD in PS2 hanno rivelato un ridotto rilascio di Ca2+ dal ER in seguito a stimolazione, e dati ottenuti utilizzando sonde in grado di misurare direttamente la concentrazione di Ca2+ nel ER (in particolare basate su equorina modificata indirizzata al ER) hanno dimostrato una diminuzione nella concentrazione di Ca2+ nel ER sia in cloni stabili che in linee cellulari esprimenti mutazioni FAD in PS2. A partire da questi risultati, i quali dimostrano che l’espressione di PS2 recanti mutazioni associate a FAD riduce il contenuto di Ca2+ dei depositi intracellulari, si è deciso di investigare i meccanismi molecolari alla base di questo fenomeno. In particolare, sono stati investigati, soprattutto mediante l’impiego di equorine indirizzate a diversi compartimenti cellulari, tre diversi aspetti dell’effetto di PS2 sull’omeostasi del Ca2+: i) il ruolo della conformazione di PS2 nel suo effetto di riduzione del livello di Ca2+ del ER; le PS sono infatti sintetizzate come proteine intere ma subiscono rapidamente una maturazione mediante taglio ad una forma dimerica quando sono incorporate nel complesso g- secretasico; ii) il coinvolgimento del leak di Ca2+ attraverso la membrane del ER nell’effetto di PS2, e più in particolare di tre diverse possibili “vie di fuga” suggerite in letteratura, RyR, IP3R e il complesso Ribosoma-Traslocone (RTC); iii) il ruolo di PS2 nell’interazione tra ER e mitocondri, un aspetto centrale nella fisiologia della cellula. Esperimenti su cellule prive di PS1 e PS2 endogene transfettate con diversi costrutti di PS2 (in grado di dare l’espressione di PS2 intera, dimerica o di entrambe) hanno dimostrato che la sua conformazione intera è necessaria per la riduzione del contenuto di Ca2+ del ER indotta da PS2; inoltre, è stato dimostrato che un aumento nel livello endogeno di PS2 intera diminuisce il livello di Ca2+ nel ER. Dati mirati a misurare la velocità di uscita del Ca2+ attraverso la membrana del ER hanno evidenziato un leak di ioni Ca2+ aumentato in cellule esprimenti PS2 associate a FAD rispetto ai controlli, e quindi si è investigato il possibile coinvolgimento di RyR, IP3R e RTC sia con approcci di tipo farmacologico (impiego dell’inibitore di RyR Dantrolene, dell’antagosista di IP3 Eparina, di Puromicina e Anisomicina, due agenti che bloccano RTC in conformazione aperta o chiusa rispettivamente) che di tipo genetico (siRNA contro le isoforme 1 e 3 di IP3R al fine di diminuirne il livello proteico), arrivando a dimostrare che la riduzione del contenuto di Ca2+ del ER indotta da PS2 è almeno parzialmente mediata da RyR e IP3R ma non da RTC. È stato inoltre valutato l’accumulo da parte dei mitocondri del Ca2+ rilasciato dal ER. Quando sono stati misurati i picchi di Ca2+ mitocondriale in cellule esprimenti PS2 e cellule di controllo in condizioni in cui il rilascio citosolico era confrontabile (le cellule di controllo venivano parzialmente pre-svuotate) si è osservato un aumento nella captazione di Ca2+ da parte dei mitocondri in cellule esprimenti PS2 wt e, in modo più pronunciato, PS2 associata a FAD. Questo fenomeno non è dovuto a un effetto diretto di PS2 sul meccanismo di ingresso di Ca2+ nei mitocondri, bensì ad un aumento nell’interazione tra i mitocondri stessi e il ER, come è stato dimostrato misurando la prossimità dei due organuli mediante microscopia confocale. L’abbattimento dei livelli proteici di PS2 grazie a siRNA ha inoltre evidenziato che la PS2 endogena può controllare il grado di interazione tra ER e mitocondri. Questi risultati sono stati infine confermati da esperimenti fatti con sonde “Cameleon” per il Ca2+, basate sul fenomeno del FRET. Complessivamente questi dati forniscono nuovi elementi sull’effetto di PS2 sull’omeostasi del Ca2+ nelle forme familiari della Patologia di Alzheimer e, più in dettaglio, sul ruolo della conformazione di PS2 e sul coinvolgimento di RyR e IP3R nel suo effeto. Un nuovo aspetto del controllo da parte di PS2 sulle dinamiche cellulari (e del Ca2+ in particolare) viene inoltre riportato per la prima volta, cioè che questa proteina può regolare la relazione tra ER e mitocondri, e che mutazioni FAD a suo carico influenzano questa interazione; questo suggerisce ovviamente nuove possibili vie di indagine sull’effetto delle mutazioni a carico delle PS nelle forme familiari di AD.