La mutazione S59P del gene TNFRSF1A, associata alla TRAPS, causa l'attivazione costitutiva della via del segnale NFkB

Introduzione. La sindrome associata al recettore del TNF (TRAPS) è una malattia genetica a trasmissione autosomica dominante a penetranza incompleta, dovuta a mutazioni del gene TNFRSF1A che codifica per iI recettore tipo I del TNF (TNFR1). Dal punto di vista clinico i pazienti presentano diversi sintomi quali febbre ricorrente associata a mialgia, sintomi gastrointestinali, artriti, pericarditi e congiuntiviti. I meccanismi cellulari che caratterizzano la patofisiologia della TRAPS sono di fondamentale importanza per comprendere il meccanismo di azione del recettore del TNF. Le diverse mutazioni presenti nel gene determinano differenti comportamenti della proteina modifcata che possono coinvolgere la diffusione, il folding proteico o il signalling intracellulare del recettore attivato. La maggior parte delle mutazioni sono localizzate nel dominio extracellulare (CRD) della proteina, coinvolto nel legame con il TNFa. Le mutazioni più drastiche coinvolgono i residui cisteinici ma e sistono anche mutazioni ad alta penetranza che non coinvolgono questi residui, come la mutazione T50M, che determinano un quadro clinico fenotipico severo e mutazioni a bassa penetranza con quadro fenotipico più variabile come la mutazione R92Q. Di recente è stata identificata una nuova mutazione della regione codificante, c.262T>C (S59P), in un paziente adulto affetto da TRAPS che determina la sostituzione aminoacidica della serina (S) i prolina (P) in posizione 59 della proteina matura. Scopi. Lo scopo del presente lavoro è stato studiare gli effetti di questa mutazione sulla via del segnale intracellulare del TNFR1 e confrontare i risultati con quelli ottenuti dalle mutazioni T50M e R92Q già note in letteratura. Metodi: è stato creato un vettore contenente il cDNA Wild Type (WT) e tre vettori con le rispettive mutazioni c.262T>C (S59P), c.362G>A (R92Q) c.236C>T(T50M) mediante reazione di mutagenesi sito-diretta. I vettori sono stati inseriti nella linea cellulare Human Embryonic Kidney (HEK293) mediante trasfezione stabile e sono state ottenute quattro nuove linee cellulari HEK WT, HEK S59P, HEK R92Q e HEK T50M. Le cellule ottenute sono state stimolate con TNFa (60ng/mL) al fine di osservare la localizzazione cellulare del recettore mediante immunofluorescenza indiretta e per valutare la fosforilazione di IkBa nel tempo mediante analisi al western blot. Le cellule sono state stimolate per 4 ore in assenza o con TNFa a diverse concentrazioni (0.6,6,60 ng/mL) per valutare il rilascio di prodotti dell'attivazione del segnale NFkB mediante analisi immunoenzimatica (ELISA). Sulla base dei risultati preliminari ottenuti abbiamo scelto di utilizzare la concentrazione intermedia di TNFa a 6ng/mL per valutare il signalling NFkB nelle cellule considerate. Dal momento che il paziente con la mutazione S59P è attualmente in terapia con anti-IL1, abbiamo utilizzato anche lo stimolo con IL1b (1ng/mL) nei modelli sperimentali. Per confrontare i risultati ottenuti con il modello in vitro, abbiamo eseguito le medesime condizioni sperimentali nei PBMC isolati dal sangue periferico del paziente affetto da TRAPS con la mutazione S59P, da un paziente con la mutazione R92Q e da cinque soggetti sani privi di mutazione nel gene del recettore del TNF (W/W). Risultati. Dall'analisi di immunofluorescanza è stato osservato che il TNFa induce un regolare 'trafficking' del TNFR nelle cellule WT, mentre la pesenza delle mutazioni determinano un accumulo, in forma di aggregati citoplasmatici, del recettore del TNF, all'interno delle cellule. Il TNFa e IL1b riducevano la fosforilazione di IkBa nelle cellule WT, mentre nelle cellule mutate si osservava un significativo incremento della fosforilazione di questa proteina. L'attivazione e traslocazione di NFkB si correla con quanto osservato. Nelle cellule WT gli stimoli infiammatori riducevano l'attivazione della subunità p65 di NFkB, mentre nelle cellule mutate l'attivazione era marcatamente indotta, principalmente da TNFa ma anche da IL1b. Lo stimolo con TNFa induceva un rilascio di IL8 significativamente più elevato nelle cellule mutate rispetto alle cellule WT. I risultati ottenuti dagli sperimenti con i PBMC dei pazienti e dei soggetti sani confermavano quanto osservato con il modello in vitro. La fosforilazione era costitutivamente aumentata nei PBMC mutati rispetto ai PBMC W/W e gli stimoli infiammatori intensificavano la fosforilazione. Lo stimolo con TNFa manteneva l'attivazione di NFkB nei PBMC mutati, inoltre nei PBMC S59P, lo stimolo con IL1b faceva persistere l'attivazione. LPS induceva un significativo rilascio di IL1b, IL6, IL8 e TNFa in tutti I PBMC considerati, indipendentemente dalla mutazione. Nei PBMC del paziente con la mutazione S59P IL1b induceva un significativo e persistente rilascio di IL6 e IL8. Conclusioni. La nuova mutazione S59P nel gene del recettore del TNF determina una proteina con una struttura conformazionale modificata da impedire la corretta distribuzione nella cellula e risulta essere attiva anche in assenza di legame con il TNFa. La presenza di questa mutazione determina l'attivazione della via infiammatoria in maniera particolarmente accentuata e persistente. Un contesto iperinfiammatorio osservato in vitro è stato confermato anche nel paziente con la mutazione S59P nonostante sia in terapia antiinfiammatoria. Questa mutazione inoltre sembra rendere le cellule particolarmente sensibili agli effetti dell'IL1b sia per l'attivazione del pathway NFkB sia per il rilascio delle citochine pro infiammatorie