Mitochondrial potassium homeostasis and its relevance in pathophysiological contexts

Durante il mio dottorato, la mia ricerca si è concentrata sul coinvolgimento e il ruolo dell'omeostasi mitocondriale di potassio (K+) in processi fisiopatologici. Ho lavorato su tre progetti correlati, per cui l'aspetto comune è lo studio dell’omeostasi del potassio mitocondriale e la sua modulazione tramite strumenti farmacologici. La mia tesi contiene un'introduzione generale, al fine di dare una descrizione generale aggiornata di tutti gli argomenti trattati durante il mio dottorato di ricerca, seguiti da una raccolta di pubblicazioni scientifiche in cui ho dato il mio contributo. Per quanto riguarda il primo progetto, i miei studi hanno fornito nuove informazioni sul meccanismo d'azione di una molecola pro-apoptotica emergente, rilevante dal punto di vista oncologico, nota come salinomicina. Questa molecola è stata considerata uno ionoforo di K+ simile alla valinomicina. La sua recente identificazione come induttore selettivo di apoptosi in cellule staminali tumorali (CSCs) e diversi tipi di cellule tumorali non-staminali, insieme alla sua capacità di risparmiare le cellule sane, ha portato a un interesse crescente verso la comprensione del suo meccanismo d'azione, poco noto finora. Inoltre, poiché è stato suggerito che la salinomicina agisca come uno ionoforo di K+, ci si aspetta un suo effetto sulla funzione mitocondriale. Tuttavia non erano disponibili in letteratura informazioni dettagliate sugli effetti mitocondriali di questa molecola. Pertanto, ho esplorato i suoi effetti istantanei sulla bioenergetica mitocondriale. Per fare questo, ho confrontato la sua attività con quella della valinomicina (ionoforo di K+) e della nigericina (scambiatore K+/H+), l'azione delle quali era già stata ben definita da altri in passato. Utilizzando diversi approcci, che vanno dagli studi bioenergetici classici su mitocondri isolati alla misurazione di parametri bioenergetici con strumenti più innovativi su cellule intatte, e, naturalmente, sfruttando diverse tecniche di biologia cellulare, si è concluso che la salinomicina media lo scambio K+/H+ attraverso la membrana mitocondriale interna , analogamente alla nigericina. Inoltre, è stato visto che la salinomicina è stata in grado di indurre la morte cellulare delle cellule prive di alcuni attori cruciali del processo apoptotico (doppio knock-out di Bax/Bak in cellule MEF). Questi risultati sono compatibili con l'idea di una modulazione diretta della funzione mitocondriale da parte della salinomicina. A questo punto, è stata studiata la specificità della sua azione su cellule B patologiche isolate da pazienti con leucemia linfatica cronica (CLL) versus cellule B di soggetti sani. I risultati hanno indicato che la salinomicina, quando usata sopra concentrazioni mM, esercita effetti mitocondriali diretti, compromettendo così la sopravvivenza delle cellule, anche di quelle non tumorali. Questi risultati sono stati pubblicati in Managò et al., Cell Death and Disease, 2015. Avendo acquisito il "know-how" per valutare le funzioni bioenergetiche mitocondriali, ho anche contribuito attivamente a un progetto realizzato in collaborazione con il Prof. Erich Gulbins dell'Università di Essen (Germania), dove ho anche trascorso cinque mesi del mio dottorato di ricerca. Una stretta collaborazione tra il laboratorio dove ho fatto il mio dottorato di ricerca e il laboratorio del Prof. Gulbins ha portato alla scoperta di un canale del potassio voltaggio-dipendente mitocondriale, mtKv1.3 e al chiarimento del suo importante ruolo durante l'apoptosi. Meccanicisticamente, è stato dimostrato che la proteina pro-apoptotica Bax interagisce direttamente con mtKv1.3 e lo inibisce, tramite un meccanismo simile a quello di alcune tossine. L'inibizione diretta di mtKv1.3 porta ad iperpolarizzazione, produzione di ROS a livello mitocondriale, apertura del poro di transizione di permeabilità (PTP), rilascio di citocromo c ed infine all'apoptosi. Secondo questo modello, l'inibizione farmacologica diretta di mtKv1.3 utilizzando inibitori di Kv1.3 permeanti la membrana come Psora-4, PAP-1 e clofazimina, porta alla morte cellulare in diversi tipi di cancro, come dimostrato dal nostro gruppo. Il punto di partenza del mio secondo progetto è stato l’evidenza che la piocianina, una tossina permeante la membrana rilasciata dal batterio Gram-negativo Pseudomonas aeruginosa mostra somiglianza strutturale alla clofazimina, un inibitore di Kv1.3 permeante la membrana. P. aeruginosa provoca infezioni polmonari nei pazienti immunocompromessi ed è noto che la piocianina induce morte cellulare nei neutrofili, che svolgono un ruolo importante nella difesa precoce acuta dell'ospite contro infezioni polmonari da P. aeruginosa. Tuttavia l'esatto meccanismo d'azione della piocianina è ancora sconosciuta quindi abbiamo voluto studiare se il suo effetto è legato all'espressione di Kv1.3, dato il ruolo cruciale di mtKv1.3 nell’apoptosi e l'affinità strutturale della piocianina agli inibitori di Kv1.3. Prima di tutto, è stato osservato dagli esperimenti di patch-clamp che la piocianina è in grado di inibire la corrente di Kv1.3. A basse concentrazioni (fino a 10 µM), la piocianina induce morte cellulare preferenzialmente in cellule esprimenti Kv1.3. Tuttavia, in letteratura la piocianina è stata utilizzata principalmente a concentrazioni più elevate (50-100 µM), poiché nell'espettorato di pazienti con infezioni da P. aeruginosa potrebbe raggiungere tale concentrazioni. Inoltre, diversi dati in letteratura hanno suggerito che la piocianina potrebbe avere un'azione mitocondriale ed è in grado di produrre elevate quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Pertanto, è stato esaminato l'impatto della piocianina sulla funzione mitocondriale con cinetiche brevi, quando usata ad alta concentrazione (50 µM). Ancora una volta, cellule intatte o mitocondri isolati sono stati usati per saggiare l'effetto di questo composto. E 'stato osservato che la piocianina determina una produzione istantanea di anione superossido a livello di siti mitocondriali e una dissipazione rapida ma incompleta del potenziale di membrana mitocondriale. Inoltre, è stato visto che la piocianina può sostituire la funzione del complesso III, mentre non altera direttamente la funzione del complesso I. Infine, è stato dimostrato che la produzione di ROS indotta dalla piocianina attiva la sfingomielinasi acida, presente anche in mitocondri. Questo evento a sua volta porta alla formazione di ceramide, induzione di apoptosi e rilascio del citocromo c. La mancanza di espressione della sfingomielinasi acida o lo scavenging di ROS indotta dalla piocianina impedisce la morte cellulare in neutrofili, che indicando che la piocianina, ad alte concentrazioni, induce la morte cellulare attraverso specie reattive dell'ossigeno mitocondriali e sfingomielinasi acida mitocondriale, indipendentemente dall'espressione del canale del potassio voltaggio dipendente Kv1.3. Questi risultati sono stati pubblicati in Managò et al., Antioxidant and redox signaling, 2015. Durante l'ultimo periodo del mio dottorato di ricerca, ho anche studiato l'effetto di alcuni derivati di psoraleni di nuova sintesi e della clofazimina per il trattamento del cancro. Per quanto riguarda il primo gruppo, essi sono inibitori specifici del canale del potassio voltaggio dipendente Kv1.3; la seconda è una molecola già in uso in clinica per il trattamento di patologie come la lebbra, che agisce anche come inibitore della corrente di Kv1.3. Grazie alla loro struttura lipofila, sono tutti permeanti la membrana, quindi in grado di raggiungere le membrane intracellulari, come la membrana mitocondriale interna dove il canale del potassio voltaggio dipendente Kv1.3 è espresso e attivo. Come accennato in precedenza, l'inibizione specifica di mtKv1.3 innesca la morte cellulare. È stato dimostrato che Psora-4, PAP-1 e clofazimina sono in grado di indurre specificamente apoptosi nelle cellule tumorali in vitro su molte linee cellulari tumorali, ex vivo su cellule B ottenute da pazienti con leucemia linfatica cronica e in vivo su modello di melanoma. A seguito di questi risultati promettenti, in collaborazione con la Prof. Cristina Paradisi (Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Padova), sono stati sintetizzati derivati del PAP-1 e della clofazimina in modo da rendere queste molecole più solubili e mitocondriotropiche (i.e.: indirizzate al mitocondrio). Ho testato prima la capacità di questi nuovi composti di indurre morte cellulare nelle cellule tumorali in vitro. Poiché i risultati ottenuti su diverse linee cellulari sono stati promettenti e l’induzione di morte cellulare era strettamente dipendente dalla espressione Kv1.3, si è deciso di testare questi composti anche in vivo in un modello di melanoma e di tumore pancreatico. Durante il mio soggiorno di due mesi al termine del primo anno di mio dottorato presso l'Istituto per la ricerca sperimentale sul cancro, Università di Kiel (Germania), ho eseguito esperimenti in vivo, usando derivati del PAP-1 e clofazimina su topi SCID iniettati con Colo357, una linea di cellule tumorali umane di pancreas esprimenti Kv1.3, ottenendo una riduzione significativa della massa del tumore (Zaccagnino, Managò et al., under submission alla rivista Oncotarget). Inoltre, i derivati del PAP-1 sono stati testati su un modello in vivo di melanoma, dando risultati rilevanti (Leanza, Romio, Becker, Azzolini, Trentin, Managò et al., manoscritto in preparazione, non incluso nella presente tesi). Il trattamento ha esercitato un effetto sul tumore, senza rilevanti effetti collaterali sui tessuti sani. Alcuni dei più promettenti derivati della clofazimina sono stati selezionati per essere testati su cellule derivanti da pazienti con leucemia mieloide acuta (AML). Ho eseguito questi esperimenti durante il mio soggiorno in Germania presso il Dipartimento di Biologia Molecolare dell'Università di Duisburg-Essen. I campioni di sangue provenivano direttamente dal reparto di ematologia della clinica universitaria di Essen. Finora, abbiamo ottenuto risultati preliminari che sono però controversi, poiché i pazienti sono stati diagnosticati a diversi stadi della malattia (cioè hanno livelli differenti di cellule patologiche nel sangue) e poiché la leucemia mieloide acuta è di per sé una malattia eterogenea a livello molecolare e citogenetico. Questi studi non sono stati inclusi nella tesi. Inoltre, ho partecipato a un progetto del laboratorio del Prof. Holger Kalthoff (Università di Kiel, Germania), riguardante lo studio del meccanismo d'azione di un estratto di alghe marine, per il quale ho eseguito gli esperimenti di bioenergetica (Geisen, Zenthoefer, Peipp, Kerber, Plenge, Managò et al., Marine drugs, 2015). Oltre ai progetti basati sull’attività in laboratorio, ho anche contribuito alla preparazione di due review, una in materia di canali ionici intracellulare in relazione al cancro (Leanza, Biasutto, Managò et al., Frontiers on Physiology, 2013) e l'altra riguardante l’utilizzo in vivo di canali ionici come bersaglio farmacologico come possibile strumento terapeutico nella cura del cancro (Leanza, Managò et al., BBA Mol Cell. Research, 2015).