Analysis of cross-linking between DNA and anthracyclines

Le antracicline sono un’importante famiglia di chemioterapici, tra queste sono usate prevalentemente l’adriamicina (doxorubicina), la daunorubicina, l’idarubicina e l’epirubicina. Sono farmaci con un ampio spettro d’azione, in particolare l’adriamicina è usata nel trattamento del cancro al seno, del linfoma di Hodgkin, del cancro al polmone, del mieloma multiplo e del cancro ovarico recidivo. Nonostante l’ampio spettro d’azione la resistenza e la severa cardiotossicità limitano l'uso di questi importanti farmaci anticancro. La ricerca di migliori derivati ha dato luogo a più di 2000 analoghi dei quali solamente pochi di essi hanno raggiunto l’approvazione clinica. Anche se il meccanismo esatto con il quale l’adriamicina esercita l’attività anticancro è incerta, il meccanismo principale coinvolge un danno nei confronti dell’enzima topoisomerasi II, un meccanismo supportato dall’intercalazione nel DNA e dalla localizzazione nucleare. La ricerca di antracicline meno tossiche e più efficaci ha portato alla scoperta della nemorubicina, un derivato della doxorubicina in cui l'azoto amminico della daunosamina è incorporato in un anello metossimorfolinico. Le indagini precliniche hanno mostrato che la nemorubicina, diversamente dalle antracicline classiche non è cardiotossica e l'attività antitumorale è mantenuta nei vari modelli di tumore resistenti alla terapia. Risultati incoraggianti sono stati ottenuti in fase I/II dove il composto è stato somministrato attraverso l’arteria intraepatica. La nemorubicina è 80-120 più potente della doxorubicina in vivo, diversamente la sua attività in vitro è solamente otto volte rispetto alla doxorubicina verso culture cellulari tumorali sensibili alle antracicline. Un recente studio ha stabilito che la nemorubicina è convertita dall’enzima CYP3A in un metabolita estremamente più citotossico, il PNU-159682. Questo metabolita è risultato dalle 700 alle 2400 volte più potente rispetto al progenitore nemorubicina verso cellule cancerose umane in coltura e ha mostrato un’efficacia significativa in diversi modelli di tumore in vivo. Studi in corso finalizzati a definire il meccanismo molecolare di azione di PNU-159682 indicano differenti effetti sul ciclo cellulare e una differente interazione col DNA rispetto al progenitore nemorubicina e alla doxorubicina. Inoltre, dati recenti indicano che PNU-159682 mantiene la sua attività anche verso cellule aventi diversi meccanismi di resistenza rispetto a diversi agenti anticancro classici, inclusa la sovraespressione del gene MDR-1, la riduzione dell’attività di topoisomerasi II e mutazioni nel gene codificante per la topoisomerasi I: quest’ultima modifica genetica conferisce resistenza in vitro alla nemorubicina [1]. Noi abbiamo usato diversi approcci sperimentali per razionalizzare l’elevata attività di questo metabolita. Test condotti in vitro nel nostro laboratorio con kinetoplast DNA hanno confermato l'inattività del metabolita nei confronti della topoisomerasi II. L'assenza dell'attività verso la topoisomerasi ci suggerisce che l’alta citotossicità di questo metabolita è da ricercarsi altrove. Antracicline come doxorubicina e daunorubicina possono legare covalentemente il DNA quando attivate con formaldeide. Inoltre è stato trovato che antracicline che hanno un’intrinseca attività a formare cross-link col DNA come la cianomorfolino-doxorubicina o la barminomicina posseggono un’alta citotossicità comparabile col PNU. Quindi abbiamo considerato la possibilità che il PNU interagisca col DNA come una antraciclina preattivata. Il nostro lavoro ha evidenziato che il PNU si comporta in modo analogo alla doxorubicina attivata (doxorubicina con formaldeide) nelle analisi di melting del DNA. PNU reagisce velocemente con oligonucleotidi a doppio filamento per formare addotti visualizzati in DPAGE. Questi addotti sono sufficientemente stabili per essere isolati tramite HPLC. La caratterizzazione ottenuta tramite spettrometria di massa ha confermato che questi complessi sono formati da DNA a doppio filamento legato all’antraciclina. Questi studi suggeriscono che la reazione tra PNU e DNA non coinvolge la formazione di un classico cross-link, ma in relazione ai risultati elettroforetici, cromatografici e di spettrometria di massa questi addotti possono essere annoverati nella famiglia dei “virtual cross-link” (VXL). I coniugati antracicline-formaldeide o le antracicline in tampone contenente formaldeide hanno la specifica abilità di intercalarsi nel DNA formando legami covalenti; un ponte etilenico lega l’ammino gruppo dell’antraciclina col 2-amino gruppo della base guaninica nel solco minore, mentre l’ altra catena del DNA è stabilizzata tramite legami idrogeno. Questa particolare combinazione di intercalazione, legame covalente e legame ad idrogeno è chiamata virtual cross-link (VXL) [2], che porta alla formazione di complessi più stabili tra le antracicline e il DNA aumentando la tossicità cellulare delle antracicline. Tra i diversi meccanismi anticancro delle antracicline, la formazione di addotti DNA-antracicline ha suscitato notevole interesse riferito alla possibilità di trovare nuovi farmaci anticancro più sicuri e più efficaci. I coniugati antraciclina-formaldeide e le antracicline cross-linkanti esibiscono un’elevata citotossicità comparabile con i classici agenti cross-linkanti. Abbiamo usato differenti antracicline con lo scopo di razionalizzare il rapporto struttura attività nella formazione del VXL. Abbiamo confermato attraverso l’analisi elettroforetica e cromatografica che l’amminozucchero e l’azoto amminico sono assolutamente necessari per la formazione del “VXL” e abbiamo discusso il ruolo della posizione 4' nella daunosamina nella modulazione di questa attività. La presenza del ponte metilenico e la sua relazione con la guanina è stata confermata mediante spettrometria di massa.