Role of the scaffolding protein Homer 1a in cardiac hypertrophy

Le proteine Homer sono una famiglia di proteine coinvolte in molte vie di trasduzione del segnale intracellulare, in cellule eccitabili e non eccitabili. Queste proteine partecipano nell’assemblaggio e nella regolazione di complessi funzionali di ‘signalling’, facilitando il ‘cross-talk’ tra recettori della membrana plasmatica e canali posti sulle membrane dei compartimenti intracellulari (Worley PF. et al., 2007). Le proteine Homer sono costitutivamente espresse nel cervello, dove svolgono la funzione di ‘scaffold’ in molti processi neuronali, quali ad esempio l’omeostasi del calcio intracellulare, la plasticità sinaptica associata all’apprendimento ed alla memoria nel cervello maturo, lo sviluppo embrionale del cervello (Xiao B. et al., 1998; Worley PF. et al., 2007; Foa L. et al., 2009). Tra le diverse varianti di splicing alternativo, l’isoforma Homer 1a agisce da dominante negativo disassemblando i complessi di ‘signalling’ formati dalle altre isoforme Homer. Il gene Homer 1a è trascritto come gene immediato precoce, la sua espressione nelle cellule neuronali è bassa in condizioni basali ed aumenta rapidamente in seguito ad attivazione neuronale (Brakeman PR. et al., 1997). Le proteine Homer sono espresse anche nel muscolo cardiaco, ma la loro regolazione e la loro funzione è ancora poco conosciuta. Nonostante l’importanza degli Homer come proteine regolatrici di complessi coinvolti nelle vie di trasduzione del segnale, pochi studi si sono focalizzati sul loro ruolo nel cuore. A tal riguardo, è stato riportato che l’mRNA codificante per Homer 1a aumenta rapidamente e transientemente in colture di cardiomiociti neonatali in seguito a stimolazione con endotelina-1 ed con altri agonisti ipertrofici (Kawamoto T. et al., 2006). Un successivo lavoro ha evidenziato che, in condizioni di ipertrofia indotta da angiotensina II, anche i livelli di espressione della proteina Homer 1a risultano up-regolati in colture di cardiomiociti neonatali (Guo WG. et al., 2010). Un recente studio ha, invece, dimostrato che l’isoforma Homer 1b/c regola positivamente l’ipertrofia dovuta a stimolazione α-adrenergica, mentre l’isoforma Homer 1a antagonizza tale effetto (Grubb DR. et al., 2011). In questo studio abbiamo esaminato il ruolo della proteina Homer 1a nell’ipertrofia cardiaca. La nostra ipotesi di lavoro è che la proteina Homer 1a sia un modulatore molecolare dell’ipertrofia. A tal fine, abbiamo studiato la presenza, la localizzazione sub-cellulare e la funzione di Homer 1a nel muscolo cardiaco. Analizzando l’espressione di Homer1a in condizioni normali è emerso che la proteina Homer 1a è espressa costitutivamente nel muscolo cardiaco di topo e ratto e nelle cellule HL-1 (una specifica linea cellulare cardiaca). Mediante immunofluorescenze su sezioni di cuore di ratto adulto (analizzate utilizzando il microscopio confocale) abbiamo esaminato la localizzazione sub-cellulare di Homer 1a che risulta essere sarcomerica e perinucleare. Successivamente, abbiamo analizzato l’espressione di Homer 1a in condizioni ipertrofiche; per questa analisi sono stati utilizzati cardiomiociti neonatali di ratto stimolati con l’agonista adrenergico norepinefrina (NE). In questo sistema sperimentale, abbiamo riscontrato un aumento significativo sia dell’mRNA che della proteina Homer 1a in seguito alla stimolazione con NE, mentre non abbiamo rilevato nessuna variazione sull’espressione della proteina Homer 1b/c (una diversa isoforma degli Homer). In cardiomiociti in coltura stimolati con NE, sono state, inoltre, analizzate le vie di trasduzione del segnale adrenergico coinvolte nell’up-regolazione di Homer 1a indotta da NE, usando specifici inibitori dei recettori α1- and β- adrenergici (prazosin e propanololo, rispettivamente). I risultati ottenuti hanno evidenziato che il prazosin, ma non il propranololo, drasticamente riduce l’up-regolazione dell’mRNA di Homer 1a indotta da NE, dimostrando che la via di trasduzione del segnale α1-adrenergico è coinvolta. L’effetto della stimolazione ipertrofica sull’espressione di Homer 1a è stato confermato anche su cellule HL-1 stimolata con NE. In questa linea cellulare abbiamo osservato che un’ora dopo la stimolazione con NE la proteina Homer 1a aumenta di un fattore 2,5. Complessivamente, questi risultati confermano la nostra ipotesi di lavoro e dimostrano il coinvolgimento della proteina Homer 1a nella trasduzione del segnale α1-adrenergico che induce ipertrofia cardiaca. Nella seconda parte di questo studio abbiamo esaminato gli effetti dell’over-espressione di Homer 1a monitorando diversi markers ipertrofici, quali la fosforilazione delle proteine MAPK/ERK1/2, la traslocazione nucleare di NFAT, l’attivazione del promotore di ANF e l’aumento delle dimensioni cellulari. I risultati hanno dimostrato che durante la stimolazione con NE Homer 1a modula la maggior parte di questi (eccezion fatta per la traslocazione nucleare di NFAT che non risulta essere variata dall’over-espressione di Homer 1a), al contrario in condizioni basali (senza stimolazione con NE) l’over-espressione di Homer 1a di per sé non ha alcun effetto. Nello specifico, i risultati ottenuti hanno rilevato che in cellule HL-1 stimolate con NE la proteina Homer 1a over-espressa significativamente riduce i livelli di fosforilazione delle proteine ERK1/2 di circa il 40%, modulando negativamente la via di trasduzione del segnale MAPK/ERK1/2. Per quanto concerne l’attività promotoriale di ANF, questa attività è significativamente ridotta di circa il 20% nelle cellule HL-1 over-esprimenti Homer 1a e stimolate con NE. Al fine di verificare la specificità di questo effetto sul promotore ANF, abbiamo condotto lo stesso esperimento over-esprimendo l’isoforma Homer 1c ed abbiamo riscontrato che, diversamente da Homer 1a, la proteina Homer 1c non ha alcun effetto sull’attività del promotore ANF in cellule HL-1 stimolate con NE. Successivamente, abbiamo analizzato l’effetto dell’over-espressione di Homer 1a sull’aumento delle dimensioni cellulari durante stimolazione con NE. I risultati ottenuti hanno dimostrato che la proteina Homer 1a è in grado di bloccare significativamente l’aumento delle dimensioni delle cellule HL-1 stimolate con NE. Nell’ultima parte di questo lavoro, abbiamo condotto un’analisi preliminare, in vivo, dell’espressione della proteina Homer 1a in tre modelli di ipertrofia, quali topi con costrizione trasversale dell’aorta, topi transgenici over-esprimenti Gαq e ratti trattati con monocrotalina. Diversamente da quanto ottenuto nel modello cellulare in vitro, in questi modelli l’espressione della proteina Homer 1a non risulta alterata dalle condizioni ipertrofiche, almeno nell’intervallo di tempo considerato. Tuttavia, per quanto riguarda questo approccio in vivo, sarà necessario analizzare l’espressione della proteina Homer 1a in un intervallo di tempo più ampio e, di conseguenza, ulteriori analisi sono richieste. In sintesi, dai nostri risultati relativi alla presenza ed alla localizzazione sub-cellulare di Homer 1a nel tessuto cardiaco è emerso che la proteina Homer 1a è costitutivamente espressa e mostra una localizzazione sarcomerica e peri-nucleare. Nei nostri modelli cellulari in vitro, l’up-regolazione di Homer 1a è un evento precoce dell’ipertrofia indotta da NE e, come dimostrato dagli studi di gain-of fuction, la proteina Homer 1a è in grado di antagonizzare l’avvio e lo sviluppo degli eventi che portano all’ipertrofia α1- adrenergica dipendente. Concludendo, i nostri dati in vitro indicano che Homer 1a è inserito in un meccanismo di feedback negativo in cui agisce come modulatore negativo, bloccando gli steps precoci dell’ipertrofia cardiaca. Tuttavia, ulteriori studi sono necessari per definire il meccanismo alla base di questo processo.