Mathematical Modeling of Electrical Activity and Exocytosis in Intestinal L-cells and Pancreatic Beta-cells

In soggetti sani, il controllo della glicemia si basa su un complesso sistema di regolazione che permette di mantenere il livello di glucosio nel sangue all'interno di un range ristretto che oscilla attorno al suo valore basale. Malfunzionamenti in questo sistema di regolazione causano diversi disordini metabolici, tra cui il diabete, caratterizzato da una iperglicemia cronica, che può portare a gravi complicanze micro- e macro-vascolari. Diversi ormoni fanno parte di questo sistema di regolazione. L'insulina, che è uno dei più importanti e maggiormente studiati, è fisiologicamente secreta ad ogni pasto dalle beta-cellule pancreatiche, a seguito dell'aumento dei livelli di glucosio per diminuirli. Altre sostanze stimolano la secrezione di insulina, ad esempio il Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) è un ormone insulinotropico rilasciato dalle L-cellule intestinali in risposta all'assunzione di cibo. Assieme ad altri ormoni, è responsabile del cosiddetto effetto incretinico, ovvere la risposta insulinica maggiore per l’assunzione di glucosio orale rispetto alla somministrazione di glucosio endovenoso, anche nel caso in cui le concentrazioni nel plasma siano le stesse. Nel diabete di tipo 2 è ridotta sia la secrezione di insulina che di GLP-1. In questo contesto, i modelli matematici in combinazione con i dati sperimentali posso aiutare nell'ottenere una visione più approfondita dei meccanismi cellulari che portano alla secrezione di entrambi gli ormoni. Nella maggior parte delle cellule eccitabili, le fasi che portano alla secrezione sono piuttosto simili: l'attività elettrica, indotta da uno stimolo esterno, fa aprire i canali di calcio voltaggio dipendenti e causa un influsso di calcio all'interno della cellula; l'aumento dei livelli di calcio permette ai granuli di fondersi con la membrana plasmatica e rilasciare il loro contenuto all'esterno della cellula. In questo lavoro, le diverse fasi che portano alla secrezione verranno analizzate attraverso una combinazione di dati sperimentali e modelli matematici, in riferimento alle L-cellule intestinali e le beta-cellule pancreatiche. Riguardo alle L-cellule intestinali, è stato sviluppato un modello matematico dell'attività elettrica per indagare il pathway stimolo-secrezione, che è ancora poco compreso. Tuttavia, è noto che due sono i meccanismi ritenuti responsabili della percezione del glucosio intestinale: il cotrasportatore sodio-glucosio (SGLT) e i canali potassio sensibili all'ATP (canali-K(ATP)). I risultati ottenuti hanno mostrato come i due meccanismi di percezione del glucosio interagiscono e suggeriscono che l'effetto depolarizzante delle correnti dovute ad SGLT è modulato dall'attività dei canali-K(ATP). Invece, il pathway stimolo-secrezione delle beta-cellule pancreatiche è noto. Per investigare alcune risposte elettrofisiologiche eterogenee e non intuitive ad antagonisti dei canali ionici, in un precedente modello matematico dell'attività elettrica nelle beta-cellule umane sono stati inseriti i canali SK e la dinamica del calcio. Utilizzando il modello sono stati studiati anche i segnali paracrini e, aggiungendo un oscillatore glicolitico al modello elettrofisiologico, sono state simulate anche le oscillazioni lente. Il modello è stato ulteriormente sviluppato includendo i canali Kir2.1, che svolgono un ruolo fondamentale nelle cellule cardiache, determinandone la forma dei potenziali d'azione. L'inserimento di questa corrente nel modello ne ha migliorato il comportamento rallentandone la dinamica. A seguito della depolarizzazione elettrica delle beta-cellule i canali di calcio si aprono permettendo l'influsso e la diffusione del calcio all'interno della cellula, che a sua volta causa l'esocitosi dei granuli di insulina. Per questo motivo, dall'analisi dell'attività elettrica, siamo passati allo studio nelle beta-cellule della relazione tra l'esocitosi dei granuli di insulina, i livelli di calcio, la distanza dai canali di calcio ed il clustering dei canali. Questo sotto-progetto è basato su dati di microscopia per fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF), che consiste nella visualizzazione simultanea di due differenti fluorofori. Il primo è utilizzato per differenziare i granuli contenenti insulina in due gruppi, quelli che vanno incontro ad esocitosi e quelli che non lo fanno. Il secondo fluoroforo, un indicatore del calcio geneticamente codificato (R-GECO), è connesso con la membrana plasmatica e permette di visualizzare i livelli di calcio in quell'area durante lo stimolo. Le simulazioni sono state effettuate utilizzando il programma CalC, che permette di implementare la diffusione ed il buffering del calcio. Il confronto delle simulazioni con i dati di microscopia TIRF ha permesso di stimare la distanza media dai canali di calcio a cui si trovano i granuli che vanno incontro ad esocitosi. Le simulazioni di diffusione del calcio sono state accoppiate ad un modello dell'esocitosi per studiare i differenti gruppi di granuli, in termini di vicinanza ai canali di calcio ed affinità al calcio stesso. In questo contesto, la cinetica dei canali di calcio durante la depolarizzazione è stata simulata attraverso un sequenza stocastica ed un setup a canale singolo è stato confrontato con un setup di tre canali clusterizzati indipendenti o sincronizzati. Le simulazioni hanno confermato che l'ipotesi di un cluster di canali aumenta in modo significativo la probabilità di fusione e una certa dipendenza tra i canali risulterebbe funzionalmente vantaggiosa. Fino a questo momento, sono stati analizzati meccanismi cellulari, che si traduco nella secrezione di insulina. Quindi, un ulteriore passo è stato quello di spostarsi ad una scala maggiore considerando l'intero pancreas. In questo contesto, i cosiddetti modelli minimi possono essere un utile approccio, in quanto permettono di determinare degli indici per valutare la funzionalità beta-cellulare in differenti gruppi sperimentali. A partire dal modello minimo del C-peptide precedentemente applicato al test endovenoso di tolleranza al glucosio, è stato sviluppato un modello minimo specifico per il setup del pancreas perfuso. Il modello è stato inizialmente applicato a pancreas non trattati e, successivamente, utilizzato per la valutazione di importanti agenti farmacologici (GLP-1, lixisenatide, un agonista del recettore del GLP-1, e SAR1, un agonista del recettore GPR40/FFAR1), quantificando e differenziando il loro effetto sulla secrezione di insulina. I risultati hanno mostrato che lixisenatide ottiene un miglioramento della funzione beta-cellulare simile al GLP-1 e che SAR1 porta ad un miglioramento ulteriore della funzionalità beta-cellulare in presenza di livelli post-prandiali di GLP-1. In conclusione, in questo lavoro diversi aspetti della secrezione di GLP-1 e di insulina sono stati studiati con una combinazione di dati sperimentali e modelli matematici. Iniziando dai modelli dell'attività elettrica sia nella L-cellule che nelle beta-cellule, siamo passati alla diffusione del calcio e all'esocitosi dei granuli di insulina, concludendo con un modello minimo della secrezione di insulina.