A possible role of superoxide dismutase 2 in the pathogenesis of parkinson disease

La malattia di Parkinson è la malattia neurologica degenerativa più diffusa dopo la malattia di Alzheimer. Meno del 5% dei casi presenta una correlazione genetica (ereditarietà autosomica dominante o recessiva). I sintomi principali caratteristici sono tremore a riposo, bradicinesia, instabilità posturale e rigidità. L’eziologia rimane ancora sconosciuta ma evidenze perimentali suggeriscono che la malattia sia multifattoriale. In particolare due fattori, disfunzione mitocondriale e stress ossidativo, sembrano avere un ruolo chiave nella patogenesi. La caratteristica della malattia di Parkinson è la perdita dei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta. Questo fa presupporre che la dopamina abbia un ruolo importante nell’eziologia attraverso il suo metabolismo. Infatti, l’ossidazione citosolica della dopamina può contribuire alla tossicità neuronale. Questo neurotrasmettitore, una volta sintetizzato, in condizioni normali è sequestrato nelle vescicole sinaptiche. Tuttavia, la disfunzione mitocondriale, in particolare l’inibizione a livello del complesso I riscontrata nella malattia di Parkinson, porta a causare una diminuzione dei livelli di ATP. Questo può influenzare il trasporto di dopamina nelle vescicole che è ATP-dipendente. La conseguenza sarebbe una ridistribuzione del neurotrasmettitore nel citoplasma, dove può auto-ossidarsi spontaneamente a pH alcalini producendo dopaminochinoni (DAQs) e specie reattive dell’ossigeno (ROS) che contribuiscono allo stress ossidativo. E’ stato suggerito che i DAQs possano essere coinvolti nella neurotossicità dei neuroni dopaminergici. Questo perchè possono interagire con le cisteine esposte sulla superficie di proteine generando 5-S-cisteinil-DA e la loro modificazione covalente da parte dei DAQs può compromettere la funzionalità e stabilità di queste proteine. Le cellule possiedono differenti meccanismi per proteggersi dallo stress ossidativo: catalasi, glutatione perossidasi e superossido dismutasi (SOD). La funzione delle SOD consiste nel dismutare l’anione superossido a perossido d’idrogeno e ossigeno molecolare. Tra le tre isoforme di SOD presenti nell’uomo, la SOD2 è particolarmente importante a causa della sua localizzazione all’interno del mitocondrio. Lo scopo di questa tesi è quello di investigare se la SOD2 sia un target dei DAQs in vitro, gli effetti di questa interazione sull’attività enzimatica della proteina e il/l residuo/i target dei DAQs. Il punto di partenza è stato il clonaggio del cDNA della SOD2 umana nel vettore pET28a+. Dato che E.coli possiede tre differenti SOD che potrebbero interferire con la purificazione, un secondo clonaggio è stato effettuato, clonando l’inserto a valle di un histidine-tag. È stato messo a punto un protocollo di purificazione della SOD2 ma la purificazione di controllo, dove le cellule erano state trasformate con il vettore senza l’inserto, ha portato alla purificazione di una SOD endogena di coli. Questo ha dimostrato che una SOD di coli co-purificava con l’enzima umano ricombinante. Per evitare questo, un protocollo di purificazione è stato ottimizzato con l’His-tag ottenendo 40-60 mg di proteina da un litro di coltura. L’interazione tra la SOD2 e i DAQs è stata indagata utilizzando differenti tecniche biochimiche e biofisiche. L’ossidazione della dopamina è stata indotta dall’aggiunta di tirosinasi, che previene la formazione di specie radicaliche normalmente prodotte durante la sua auto-ossidazione. È stato verificato che la tirosinasi non interagisce con i residui tirosinici della proteina. La SOD2 è stata incubata con differenti rapporti SOD2:dopamina in presenza di tirosinasi, seguendo la formazione dei DAQs con spettroscopia UV-visibile. L’interazione di questi prodotti con la proteina è stata studiata tramite spettrometria di massa, che ha rilevato la formazione di nuove specie le cui masse erano compatibili con la modificazione covalente di una cisteina con il dopamino-o-chinone e con l’indolo 5,6 chinone. Altre specie sono state identificate ma non è stato possibile attribuirle ad uno specifico chinone, quindi queste potrebbero essere il risultato di interazioni più complesse. Inoltre, la presenza di una doppia modifica ha suggerito la possibile interazione di entrambe le cisteine della proteina. Analisi su SDS-PAGE dei prodotti di reazione ha mostrato la presenza di dimeri di proteina e aggregati. Native-PAGE ha rilevato un pattern di bande multiple e aggregati, dopo interazione con i chinoni. Il profilo delle bande multiple è stato attribuito alla combinazione monomeri di SOD2 con differenti modifiche (come dimostrato dalle analisi di spettrometria di massa) associati a formare tetrameri. Questo è supportato dal profilo nel gel bidimensionale, dove sono presenti 4 prodotti di SOD2 con differente punto isoelettrico. Il saggio enzimatico ha rilevato che la proteina modificata ovalentemente dai DAQs risulta essere inibita. Misure di radiolisi pulsata sono state effettuate per determinare i parametri cinetici della reazione di dismutazione. Per identificare i siti di interazione dei DAQs, le cisteine sono state mutagenizzate in alanine ottenendo i seguenti mutanti: C140A, C196A e C140A/C196A. L’incubazione dei mutanti con C14-dopamina ha dimostrato che il target primario dei DAQs è la cisteina 196. Questo risultato è stato confermato anche da analisi di spettrometria di massa. L’attività enzimatica del mutante 140 dopo interazione con DAQs risulta essere minore rispetto alla proteina non modificata. Un debole segnale di radioattività è stato trovato anche in associazione con il mutante 196 e il doppio. Ciò suggerisce la presenze di un sito di interazione con i chinoni secondario. Dato che due modificazioni dovute a DAQs sono state trovate incubando il mutante C140A, si deduce che il secondo sito di interazione coinvolga un altro residuo nucleofilo. Cambiamenti strutturali della SOD2 suggeriscono precipitazione della proteina un possibile cambiamento della struttura terziaria. Inoltre modificazioni rilevanti nella coordinazione del metallo non sono state rilevate mediante HFEPR. I risultati presentati in questa tesi dimostrano che la SOD2 è un target dei DAQs in vitro suggerendo l’idea che la SOD2 possa essere coinvolta nella malattia di Parkinson. Una volta modificata dai DAQs, lo stress ossidativo aumenterebbe nei mitocondri, a causa della inibizione dell’attività dismutasica dell’enzima, determinando disfunzione mitocondriale e contribuendo alla morte neuronale.