Functional characterization of the p13 protein of HTLV-1

Il virus T-linfotropico umano di tipo 1 (HTLV-1) è associato all'insorgenza della leucemia-linfoma a cellule T dell'adulto (ATLL), un'aggressiva neoplasia dei linfociti T CD4+ maturi, e della mielopatia associata ad HTLV-1/paraparesi spastica tropicale (HAM/TSP), una patologia degenerativa del sistema nervoso centrale. HTLV-1 è classificato come retrovirus complesso in quanto il suo genoma codifica, oltre a proteine strutturali (gag, env, pol), anche proteine regolatorie (Tax e Rex) ed accessorie (p30, p12, p13, HBZ), dalla funzione ancora non del tutto chiarita. Precedentamente è stato dimostrato che la proteina accessoria p13 (la cui sequenza è costituita da 87 aminoacidi) si localizza nella membrana mitocondriale interna ed induce marcata frammentazione di questi organelli. Mediante studi in vitro condotti con p13 sintetica e mitocondri isolati è stato dimostrato che p13 induce un influsso di potassio (K+) potenziale-dipendente all'interno della matrice mitocondriale. L'alterazione della permeabilità mitocondriale indotta da p13 è accompagnata da una depolarizzazione dose-dipendente e da una riduzione della soglia di apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale (PTP). L'influsso di K+ è dovuto alla presenza di un dominio anfipatico ad α-elica (tra gli aminoacidi in posizione 21 e 30), in cui le quattro arginine in posizione 22, 25, 29 e 30 svolgono un ruolo fondamentale per la funzione di p13. p13 rallenta la proliferazione cellulare, promuove l'apoptosi mediata da ceramide e Fas L e interferisce con la crescita tumorale in modelli sperimentali in vivo. Gli studi descritti nella presente tesi sono stati mirati alla analisi degli effetti di p13 a livello mitocondriale in cellule vitali. Usando la sonda potenziale-dipendente tetrametil-rodamina-metil-estere (TMRM), è stato dimostrato che p13 induce una depolarizzazione mitocondriale dose-dipendente in cellule HeLa. Il mutante p13RQ, che non altera la permeabilità della membrana interna al K+, non ha evidenziato effetti a livello del potenziale di membrana mitocondriale (∆ψ). Risultati analoghi sono stati ottenuti utilizzando cellule T come modello cellulare. Dato che il ∆ψ è fondamentale nel controllo dell'ingresso di calcio (Ca2+) nel mitocondrio, abbiamo analizzati gli effetti di p13 nell'omeostasi del Ca2+. A tal fine abbiamo utilizzato la sonda Ca2+-sensibile equorina, specifica per dati compartimenti cellulari. I risultati di questa analisi hanno evidenziato che, in seguito a stimolazione con istamina, l'influsso mitocondriale di Ca2+ risulta ridotto in presenza di p13, che invece non induce alterazioni nella concentrazione di Ca2+ del citoplasma e del reticolo endoplasmatico. Questo effetto suggerisce che p13 potrebbe controllare fondamentali processi, regolati da Ca2+, come l'attivazione e la morte delle cellule T. L'osservazione dell' eterogeneità dell' effetto di p13 sul ∆ψ, a livelli intermedi di espressione, ha suggerito l'esistenza di meccanismi preposti alla regolazione della funzione della proteina. Abbiamo quindi analizzato il ruolo della fosforilazione come possibile evento regolativo della funzione di p13. In particolare, è stata individuata la serina in posizione 15 come possibile sito di fosforilazione da parte di protein-chinasi C (PKC). S15 potrebbe essere un sito chiave per la regolazione della funzione di p13 poiché è localizzata vicino al dominio funzionale ad α-elica, responsabile dell'influsso di K+ nella matrice mitocondriale. Saggi di fosforilazione in vitro condotti sui peptidi sintetici p13[9-22] e p13S15A[9-22] hanno confermato la fosforilazione di S15 da parte di lisati cellulari (mitocondriale e citosolico) di cellule T Jurkat, oltre che da parte di una miscela commerciale di PKC, come fonte di chinasi. La reazione di fosforilazione in vitro da parte di lisati cellulari è stata anche confermata sulla proteina sintetica p13[1-87]. Risultati preliminari ottenuti mediante esperimenti di elettroforesi bidimensionale di lisati di cellule T Jurkat trasfettate transientemente con p13 hanno dimostrato che la proteina, espressa in cellule T, esiste in due forme principali, che differiscono per punto isoelettrico (pI). Sono stati inoltre analizzati gli effetti funzionali della fosforilazione di S15 producendo dei mutanti fosfomimetico (p13S1D) e fosfoablativo (p13S15A) e studiando le loro proprietà in cellule HeLa. I risultati di questi studi hanno evidenziato che la presenza della carica negativa nel residuo 15 rafforza gli effetti di p13 nell'induzione della frammentazione mitocondriale. Mediante saggi di incubazione con TMRM è stato dimostrato che il mutante fosfomimetico induce depolarizzazione mitocondriale ad un livello di espressione inferiore rispetto alla proteina wild-type. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che la fosforilazione in S15 possa influenzare le proprietà biologiche di p13. Questo studio apre la strada ad ulteriori indagini, finalizzate all'analisi di questo e di altri meccanismi alla base della regolazione della funzione di p13.