ROLE OF LIPOSOLUBLE HORMONES AND MATERNAL mRNAs IN THE EPIGENETIC LONG-TERM MODULATION OF ZEBRAFISH DEVELOPMENT

PARTE I: Analisi dell’espressione degli mRNA materni e zigotici per recettori di ormoni steroidei durante lo sviluppo nel pesce zebrato (Danio rerio). Ho analizzato mediante qRT-PCR e/o RT-PCR la presenza ed il grado di degradazione degli mRNA materni codificanti per nove recettori di ormoni steroidei, e la loro possibile sostituzione da parte dei trascritti embrionali corrispondenti, sia negli ovociti ovulati che in embrioni di pesce zebrato raccolti a 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24 e 48 ore dopo la fecondazione (hpf). Gli mRNA studiati sono quelli codificanti i recettori nucleari per il progesterone (Pr), gli androgeni (Ar), gli estrogeni (Erα, Erβ1 ed Erβ2), i glucocorticoidi (Gr), i mineralcorticoidi (Mr) ed i recettori di membrana α e β per i progestinici (mPrα e mPrβ). L’mRNA codificante la proteina Gr costituisce il trascritto materno maggiormente presente negli ovociti e nei primi stadi di sviluppo embrionale, seguito dagli mRNA codificanti i recettori Erβ2 ed Ar. Tutti questi trascritti diminuiscono durante le prime 8 ore di sviluppo, e vengono poi sostituiti dai rispettivi messaggeri embrionali. I livelli dei trascritti per erβ1 e mr sono bassi prima delle 8 hpf, ed aumentano costantemente, dopo l’inizio della trascrizione embrionale, passando dalle 24 alle 48 hpf. L’mRNA codificante il recettore Pr è stato rilevato soltanto negli ovociti ovulati e nei campioni corrispondenti a 24 e 48 hpf. A questi stadi di sviluppo c’è anche un leggero aumento dell’mRNA codificante la proteina Erα. I trascritti per i recettori mPrα e mPrβ sono presenti negli ovociti ovulati e persistono, a basse concentrazioni, fino alle 4 hpf. Non è stata evidenziata la presenza di trascritti embrionali codificanti per questi due geni. E’ interessante il possibile coinvolgimento degli mRNA codificanti Gr e i recettori degli ormoni sessuali nella programmazione dello sviluppo embrionale precoce del pesce zebrato, dal momento che sono presenti principalmente negli stadi di sviluppo in cui la replicazione genica predomina sulla trascrizione. PARTE II: Inattivazione genica del recettore dei glucocorticoidi di pesce zebrato mediante morfolino Il recettore dei glucocorticoidi (Gr) è coinvolto in numerosi processi fisiologici, tra cui la crescita, l’osmoregolazione e la riproduzione in molte specie di vertebrati. In questo studio, ho analizzato la funzione del Gr durante l’embriogenesi di pesce zebrato utilizzando la tecnologia degli oligonucleotidi antisenso morfolino per inibire la traduzione dell’mRNA codificante Gr. Ho osservato che i morfanti di Gr presentano occhi e testa di dimensioni ridotte, corpo corto, edema pericardico, riduzione della pigmentazione, mancata insufflazione della vescica natatoria, coda incurvata e comportamento natatorio anormale. L’efficacia dell’inattivazione genica del Gr sono stati verificati mediante Western blotting ed utilizzando un sistema di trascrizione e traduzione in vitro, che hanno dimostrato una riduzione della traduzione del Gr negli embrioni morfanti. Analisi di microarray hanno messo in evidenza che questa proteina funziona prevalentemente come repressore della trascrizione genica. I geni caspase-8, igf2α e centaurina-1α risultati sovraespressi mediante microarray dopo trattamento con morfolino, sono stati analizzati mediante RT-PCR semiquantitativa durante tutto il corso dello sviluppo embrionale. Inoltre, esperimenti di ibridazione in situ in toto indicano che, mentre in generale il modello di espressione dei marcatori utilizzati non cambia nei morfanti, tre marcatori coinvolti nel processo di neurogenesi, e cioè egr2b, emx1 e six3.1, sono risultati sovraespressi. In conclusione, i risultati ottenuti dall’inattivazione genica del gr di pesce zebrato rivelano la necessità dei trascritti di origine materna in molteplici processi di sviluppo, quali neurogenesi e formazione di intestino ed organi accessori. Si dovrà comunque analizzare più in dettaglio la transizione funzionale dai trascritti materni a quelli zigotici e stabilire se essi influenzino componenti distinti dei meccanismi a livello genomico.