SVILUPPO DI NUOVE STRATEGIE ANTIVIRALI DIRETTE CONTRO L' RNA POLIMERASI DEL VIRUS DELL'INFLUENZA

L'influenza è un'infezione respiratoria, di origine virale, caratterizzata da elevata morbidità  e mortalità  soprattutto nella popolazione ad alto rischio (bambini, anziani, pazienti con malattie croniche/debilitanti, ecc.). Ogni anno il 20% della popolazione è affetto da un'epidemia causata dalla variabilità antigenica dei diversi ceppi di influenza, questo comporta che il vaccino anti-influenza debba essere riformulato di anno in anno con un considerevole impatto economico. Inoltre il virus dell'influenza è responsabile di pandemie occasionali che colpiscono milioni di persone in tutto il mondo e che si verificano ogni 10-30 anni con incidenza di morte dell'ordine del milione. Gli uccelli selvatici (uccelli acquatici, anatre selvatiche, etc.) sono il serbatoio naturale del virus aviario, e i recenti casi di influenza aviaria che hanno colpito l'uomo indicano che una nuova epidemia influenzale potrebbe essere in grado non solo di saltare le barriere tra le specie ma anche di trasmettersi da uomo a uomo causando milioni di morti. Per questi motivi esiste la necessit  di trovare un nuovo farmaco che abbia come bersaglio un elemento virale conservato. Attualmente esistono in commercio pochi farmaci anti-influenza, che hanno come bersaglio alcune proteine virali di superficie: neuraminidasi (NA) e una proteina che costituisce un canale ionico (M2). Oseltamivir (Tamiflu) e zanamivir sono inibitori di NA e prevengono il rilascio delle particelle virali dalle cellule infettate (per flu A e flu B). Amantadina e rimantadina invece hanno come bersaglio la proteina M2, e agiscono sulla scapsidazione del virus. Questi farmaci presentano però numerosi svantaggi: possono avere effetti collaterali causando tossicità  a livello neurologico, non possono essere somministrati al di sotto dei 12 anni di età , infine per essere efficaci devono essere assunti entro le 48 ore dall'insorgenza dei sintomi; inoltre, per tali farmaci si è registrata la comparsa di molti ceppi virali resistenti. Il vaccino anti-influenza che viene messo a disposizione per la popolazione ha lo svantaggio di dover essere riformulato ogni anno a causa dell'elevata variabilità  antigenica dei diversi ceppi. Di fatto, non esiste una terapia efficace e persiste quindi una necessità  reale di sviluppare nuovi farmaci anti-influenza soprattutto dotati di un meccanismo d'azione diverso da quello dei farmaci attualmente a disposizione. Un possibile bersaglio per lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali è l'RNA polimerasi codificata dal virus dell'influenza, in quanto è un elemento conservato fra i diversi ceppi virali e non è soggetto a riassortimento genico. Le tre subunità  proteiche che costituiscono la RNA polimerasi virale (un eterotrimero costituito da PB1, PB2 e PA in rapporto stechiometrico 1:1:1) interagiscono fisicamente tra loro e, in particolare, la subunità  PB1 interagisce sia con PB2 che con PA, ma non c'è interazione tra PB2 e PA. E' stato dimostrato che l'interazione PA/PB1 è essenziale per la replicazione del virus dell'influenza: infatti l'inibizione di questa interazione causa anche inibizione della replicazione virale. L'utilizzo della polimerasi come target farmacologico permetterebbe quindi di inibire la replicazione virale ovviando al problema della variabilità  antigenica e si otterrebbe un farmaco attivo contro moltissimi, se non tutti, i ceppi del virus dell'influenza. Il fatto che il sito di legame PA-PB1 sia molto conservato e che l'interazione sia cruciale per molte funzioni virali fa sì che esso rappresenti un potenziale bersaglio per lo sviluppo di nuovi composti antivirali. Scopo di questo progetto è stato quello di identificare small molecules in grado di dissociare l'interazione fisica tra le subunità  PB1 e PA della RNA polimerasi del virus dell'influenza e quindi la replicazione virale. E' stato condotto uno screening in silico di molecole, a partire da circa 3 milioni di composti virtuali, utilizzando la struttura cristallografica del complesso PA/PB1 e ne sono state identificate 32 potenzialmente capaci di inibire questa interazione. Questi 32 composti sono stati inizialmente saggiati mediante ELISA, per verificare la loro effettiva capacità  di dissociare in vitro l'interazione PA/PB1. Da questa prima analisi sono stati identificati 3 composti in grado di dissociare l'interazione con un valore di IC50 comparabile al peptide corrispondente ai 15 aa di PB1, che rappresenta la regione di interazione con PA e che è stato dimostrato essere sufficiente per inibire l'interazione PA/PB1. Successivamente è stata valutata la citotossicità  delle molecole e sono stati disegnati dei composti analoghi a quelli maggiormente attivi per cercare di aumentarne l'attività  antivirale e/o diminuirne la citotossicità . L'attività  dei composti è stata confermata mediante minireplicon assay, un saggio cellulare che permette di determinare l'effetto delle molecole sull'attività  polimerasica sia del virus dell'influenza A che B. Sono stati identificati alcuni composti in grado di inibire l'attività  polimerasica virale con un valore di IC50 comparabile a quello del peptide di controllo. E' stata valutata, a questo punto, la capacità  dei composti di inibire la replicazione virale mediante saggio di riduzione delle placche. Quello che è emerso è che 3 composti inibiscono la replicazione del virus A/PR/8/34 con valori di EC50 comparabili a quelli della ribavirina (RBV), utilizzata come controllo, e a quelli dei farmaci attualmente utilizzati in terapia. Inoltre, è stata valutata la capacità  di questi composti di inibire anche la replicazione di un virus dell'influenza B (B/Malaysia/2506/4) e altri ceppi di influenza A (A/WSN/67/05, A/Solomon Island/3/06 e A/PARMA/24/09 Tamiflu-resistente). E' stato osservato che i composti 1 e 34 sono attivi contro questi ceppi di influenza in maniera analoga al composto di riferimento RBV (EC50 18-22,5 µM composto 1; EC50 17-25 µM composto 34; EC50 7-18 µM RBV). Per il composto 34 è stata anche valutata l'attività  antivirale nel tempo; quello che è emerso è che una elevata attività  è mantenuta fino a 12 h post-infezione (1-2 µM). L'attività  antivirale dei composti 1 e 34 è stata valutata anche caratterizzando il loro effetto sull'espressione delle proteine virali. Entrambi i composti hanno mostrato attività  antivirale. Inoltre à stato determinata l'attività  del composto 34 sulla traslocazione intranucleare del complesso PB1/PA; il composto 34 ha mostrato attività antivirale anche in questo saggio. Studi per caratterizzarne ulteriormente l'attività e per identificarne dei nuovi analoghi possibilmente più attivi sono in corso. In parallelo sono stati saggiati alcuni Stealth siRNA disegnati contro il trascritto di PB1 per valutare la loro capacità  di inibire l'attività  polimerasica. Dati precedenti hanno dimostrato attività  antivirale per uno di questi siRNA in cellule infettate; la capacità  di inibire anche l'attività  polimerasica è stata confermata mediante minireplicon assay (inibizione dell'80% a concentrazione 30 nM). Possiamo quindi concludere di aver identificato due composti, composto 1 e 34, e un siRNA che possono essere considerati dei buoni candidati per lo sviluppo di un farmaco anti-influenza. Ci proponiamo di caratterizzare ulteriormente l'attività  antivirale dei composti identificati, e, per quanto riguarda i composti selezionati mediante lo screening in silico, di identificare dei composti analoghi in modo da aumentare la loro attività  antivirale.