Definizione di cocktail citochinici per l'espansione, in condizioni FBS-free, di cellule stromali mesenchimali isolate da tessuto adiposo e cordone ombelicale

Le cellule stromali mesenchimali umane (hMSC) sono cellule multipotenti, isolate da numerosi tessuti, con capacità di autoreplicarsi e di differenziarsi in più linee cellulari (osteoblasti, condrociti, adipociti, ecc.). Interagiscono con le cellule staminali ematopoietiche (HSC) e hanno proprietà immunomodulanti. Queste caratteristiche hanno reso le MSC eccellenti candidate per la medicina rigenerativa e la terapia genica. Fino ad oggi il midollo osseo (BM) ha rappresentato la fonte principale di MSC, ma nell’ultimo decennio sono state sollevate delle riserve: 1) la bassa frequenza che richiede un’espansione ex vivo; 2) la comparsa di senescenza con il progredire dell’età del donatore; 3) la procedura di prelievo invasiva. Questo ha spinto i ricercatori ad investigare, da una parte, fonti alternative e, dall’altra, nuovi protocolli di espansione per bypassare gli inconvenienti associati all’uso del siero fetale bovino (FBS) e di plasma umano arricchito di piastrine (hPRP). Le principali limitazioni sono legate, per l’FBS, al rischio di trasmissione di malattie prioniche e di reazioni immunitarie causate dalle proteine xenogeniche; per hPRP, alla sua composizione variabile, ad un effetto clinico poco conosciuto e, soprattutto, all’alta quantità di sangue intero richiesto per ottenere un volume di hPRP autologo sufficiente per l’espansione ex vivo delle MSC. In più, la centrifugazione ad alte g, nel tentativo di rimuovere le membrane delle piastrine, decresce l’effetto proliferativo di hPRP. In questo studio sono state prese in esame due fonti alternative: 1) il tessuto adiposo (AT), da dove le MSC sono ottenibili in alto numero e con una facile procedura enzimatica; 2) il cordone ombelicale (UC), dal quale sono isolabili, come riportato in letteratura, MSC caratterizzate da frequenza e capacità replicativa maggiori rispetto alle BM MSC. Per la prima volta è stato valutato, misurando l’incorporazione della bromo-deossiuridina nel DNA neosintetizzato, l’effetto sulla proliferazione di AT e UC MSC di un pool di sette fattori di crescita (GF) umani ricombinanti: epidermal growth factor (EGF), basic-fibroblast growth factor (bFGF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), hepatocyte growth factor (HGF), insulin-like growth factor I (IGF I), platelet-derived growth factor-bb (PDGFbb) e transforming growth factor β1 (TGFβ1). Sono stati così definiti due cocktail a base di EGF-bFG-PDGFbb per le AT MSC e EGF-PDGFbb per espansione delle UC MSC in un mezzo FBS-free supplementato con plasma umano povero di piastrina (hPPP, 3%), che supporta la crescita delle mesenchimali minimizzando l’apoptosi e consente l’azione dei GF. Queste combinazioni di citochine sono state in grado di fornire, dopo 21 giorni di coltura, un numero sufficiente di cellule per un eventuale trattamento, ad esempio, della graft versus host disease (GvHD), partendo da 100-150 cm3 di AT e 20-30 cm di UC. Inoltre, nelle condizioni di coltura definite, sono serviti circa 80 ml di hPPP ottenibili da 150-200 ml di sangue intero, invece dei 350 ml di hPRP ricavabili da 1000-1200 ml di sangue. La risposta mitogenica riscontrata sembra coinvolgere due protein-kinasi specifiche, MEK1 e MEK2, come evidenziato in presenza di un loro inibitore specifico (U0126). Questo suggerisce la priorità di questa via nel mediare la risposta mitogenica massima delle citochine. I cocktail, inoltre, non influenzano l’espressione dei marker di superficie caratteristici delle mesenchimali. CD 105, CD 90 e CD 44 sono risultati altamente espressi sia sulle AT che sulle UC MSC, mentre la percentuale di cellule positive al CD 31, CD 34, CD 117 e CD 45 decresceva con il progredire dei passaggi, in linea con i criteri definiti dall’International Society for Cellular Therapy. Le aldeidi deidrogenasi (ALDH), una classe di enzimi ossidativi, sono state di recente proposte come marker per l’identificazione e l’isolamento delle HSC dove sono espresse ad alti livelli (>80% nelle cellule CD 34+ isolate dal sangue della vena del cordone ombelicale). In questo studio si è indagato se le ALDH potessero svolgere un ruolo analogo per le MSC. I risultati ottenuti hanno evidenziato che le ALDH, combinate con CD 45 e CD 105, non possono essere usate come marker identificativi per le MSC derivate da AT e UC a causa della loro bassa espressione (inferiore al 50%). La capacità differenziativa in senso adipogenico ed osteogenico, testato a fine del secondo passaggio (P2), è stata confermata per la AT MSC. L’esposizione a EGF-bFGF-PDGFbb ha incrementato l’adipogenesi e l’osteogenesi rispetto alla coltura in FBS e hPPP, probabilmente le citochine stimolano l’attivazione dei pathway coinvolti nel differenziamento adipogenico ed osteogenico. L’utilizzo di cellule mesenchimali “indirizzate” al differenziamento adipogenico potrebbe rappresentare una promettente risorsa in chirurgia plastica e ricostruttiva per la ricostruzione del seno dopo mastectomia, per la riparazione di difetti tissutali e subdemici conseguenti a traumi o ustioni. Per le AT MSC è stata riferita una potenzialità osteogenica inferiore alle altre MSC adulte. Con il cocktail definito, che predispone le AT MSC anche all’osteogenesi, questo “problema” potrebbe essere superato, garantendo un numero sufficiente di precursori osteogenici per il popolamento di uno scaffold. Le UC MSC, forse a causa della loro età ontogenia, non hanno evidenziato mineralizzazione e la formazione di vacuoli lipidici, ma si sono dimostrate più immunocompetenti delle AT MSC in presenza dei GF. L’effetto immunomodulante, a carico dei linfociti T attivati con fitoemagglutinina, è stato registrato per le UC MSC ad un rapporto MSC: cellule T pari a 1:10 in tutte le condizioni testate. L’immunomodulazione indotta dalle AT MSC è stata invece riscontrata a 1:5 in presenza del cocktail risultando così più blanda di quella in FBS. Probabilmente i fattori di crescita, inducendo la maturazione e predisponendo le cellule al differenziamento, compromettono le potenzialità immunomodulanti delle mesenchimali isolate da AT. Le UC MSC, essendo invece più immature, sono forse meno suscettibili all’azione dei GF rispetto alle MSC adulte. Quando tra mesenchimali e linfociti si è interposta una “barriera” che ne impediva il contatto “fisico”, non è stato rilevato alcun blocco significativo della proliferazione delle cellule T. Si può concludere che il contatto cellulare rappresenti la condizione necessaria per attivare i meccanismi di immunosoppressione come la produzione di fattori solubili. Recentemente, si sono moltiplicati i trial clinici dove si vanno ad infondere cellule CIK (cytokine induced killer) con lo scopo di aumentare l’efficienza del trapianto di HSC. Le cellule CIK sono una popolazione linfocitaria CD 3+ CD 56+, espanse in vitro con interferone γ, anti CD3 e interleuchina 2, e dotate di azione citotossica verso numerosi target tumorali, ma non sulle staminali CD 34+. Visto il ruolo rilevante in campo ematologico sia delle MSC che delle CIK, è stata indagata l’interazione tra le due popolazioni cellulari. Le CIK hanno mostrato un’azione citotossica sulle UC MSC dose dipendente, mentre le mesenchimali hanno determinato la soppressione delle CIK e la riduzione della loro potenzialità citotossica a carico della K562, un target tumorale. Questi risultati dovrebbero essere tenuti presenti nella definizione di nuovi protocolli clinici di immunoterapia. Essi suggeriscono di somministrare prima le mesenchimali al fine di supportare l’attecchimento delle HSC e prevenire la GvHD, e solo in un secondo tempo le CIK ad azione antitumorale. In conclusione, i cocktail definiti garantiscono l’espansione di una popolazione omogenea di mesenchimali e in numero sufficiente per l’uso clinico delle AT MSC “committed” in medicina ricostruttiva, e delle UC MSC in un contesto ematologico in combinazione con le cellule CIK a patto di una somministrazione in due tempi.