Enzimi farmaco-metabolizzanti epatici in specie di interesse veterinario

Nel corso dei tre anni di dottorato sono stati sviluppati progetti relativi alla valutazione dell’attività epatica di isoforme di citocromo P450 in specie di interesse veterinario. In medicina veterinaria, la caratterizzazione del sistema P450 è ancora incompleta; inoltre, i substrati utilizzati sono stati selezionati sulla base delle conoscenze disponibili a partire da esperimenti condotti nell’uomo o nelle specie di laboratorio senza studi di cinetica enzimatica o di inibizione (Fink-Gremmels, 2008). Definire il contributo di un’isoforma di citocromo P450 nel metabolismo di un farmaco specifico è importante non solo per la farmacologia e la tossicologia veterinarie ma anche per la salute dell’uomo, per la possibile presenza di residui nei prodotti di origine animale. L’obiettivo della presente tesi di dottorato è stato dunque quello di aumentare le conoscenze sugli enzimi che metabolizzano i farmaci in specie di interesse veterinario e sulla modulazione della loro attività. Tale modulazione può essere dovuta a fattori come la razza ma anche all’esposizione ad inquinanti ambientali oppure alla somministrazione di sostanze illecite utilizzate allo scopo di determinare incremento ponderale, riduzione degli indici di conversione alimentare e quindi aumento complessivo del reddito (Johnson, 2007). Le informazioni ottenute con tali studi in vitro dunque possono essere utili per valutare l’effetto di interazioni tra farmaci e per il disegno sperimentale di progetti volti all’identificazione di marker in vivo di esposizione o trattamento. I) Valutazione dell’attività di CYP1A e CYP2C nel fegato di bovino. Nel presente lavoro, sono stati verificati accuratezza, precisione, LOD e LOQ di metodi in High Performance Liquid Chromatography (HPLC) precedentemente messi a punto nel laboratorio per la valutazione dell’attività di etossiresorufina-O-deetilasi (EROD) e tolbutamide metil-idrossilasi (TMOH) in microsomi epatici di bovino allo scopo di determinare i parametri di cinetica enzimatica: rispettivamente 0,23 ± 0,051 e 1010 ± 155,7 μM per la Km e 0,488 ± 0,035 e 0,089 ± 0,006 nmol/min/mg proteina per laVmax. La sensibilità dei metodi messi a punto ha permesso di valutare anche livelli di attività enzimatica molto bassi come quelli dei vitelli a carne bianca che vengono alimentati con una dieta a base di sostitutivi del latte e basso contenuto di ferro. Infine, per verificare l’esistenza di differenze intra-specifiche nell’attività enzimatica, le attività di EROD e TMOH sono state determinate utilizzando microsomi epatici di bovini di razza Charolais (CH), Blonde D’Aquitaine (BD) e Piemontese (PM). I risultati ottenuti per l’attività di EROD hanno evidenziato una maggiore attività nei bovini di razza CH vs PM (p<0,05). E’ stata dunque dimostrata, per la prima volta, l’esistenza di differenze intra-specifiche dovute alla razza relative a questa attività enzimatica, confermando quanto evidenziato da altri autori in relazione ad attività CYP3A-dipendenti (Dacasto et al., 2003). Tali differenze potrebbero influenzare la biodisponibilità e l’efficacia clinica di xenobiotici (Sallovitz et al., 2002) e potrebbero essere di particolare interesse nelle specie di interesse veterinario per l’ipotetica presenza di residui potenzialmente tossici negli alimenti di origine animale. Per quanto riguarda invece l’attività di TMOH non sono state evidenziate differenze statisticamente significative. II) Valutazione dell’attività di idrossilazione del testosterone nel fegato di bovino: studio di cinetica enzimatica e di inibizione. In questo studio è stata valutata, tramite analisi in HPLC, la cinetica delle reazioni di idrossilazione del testosterone (TST) in vitro, con microsomi epatici di bovino. I parametri di cinetica enzimatica per le attività di 6b–, 16b– e 2b –TST idrossilasi (OHT) sono risultati 93,4±13,8, 36,4±6,1 e 110,8±15,2 ±M rispettivamente, per la Km e 0,558±0,03, 0,280±0,013 e 0,338±0,017 nmol/min/mg proteina per la Vmax.. Inoltre sono stati effettuati degli studi di inibizione chimica con inibitori di CYP3A (chetoconazolo) e di CYP2B (orfenadrina e 9-etinilfenantrene) per definire il coinvolgimento di CYP3A e potenzialmente di CYP2B in queste reazioni enzimatiche. I risultati ottenuti sono stati ulteriormente confermati con l’impiego di un anticorpo anti-peptide contro CYP3A4 di bovino. Dopo aver valutato la sua specificità con microsomi epatici di bovino, sono stati effettuati degli studi di immunoinibizione, che hanno evidenziato un’inibizione > 90% per le attività di 16b– e 2b –OHT e > 80% per 6b–OHT. Nel complesso, questi risultati sembrerebbero suggerire il coinvolgimento predominante di CYP3A nella produzione dei tre principali metaboliti del TST nel fegato di bovino mentre CYP2B non sembrerebbe essere coinvolto. III) Effetti di trattamenti illeciti su CYP3A nel fegato del bovino da carne e in colture primarie di epatociti di bovino. L’obiettivo principale di entrambe le prove sperimentali descritte è stato quello di dimostrare l’applicabilità del metodo HPLC e del substrato TST per la valutazione dell’attività enzimatica CYP3A-dipendente, allo scopo di verificare l’effetto del trattamento e di acquisire ulteriori evidenze sperimentali rispetto ai risultati di studi precedentemente coinvolti dal nostro gruppo di ricerca sul vitello a carne bianca e sul vitellone. In un primo esperimento, sono state determinate le attività di 6b-, 16b- e 2b-OHT in microsomi epatici di bovini trattati con desametazone (D) e desametazone + estradiolo (DE). I risultati ottenuti hanno evidenziato un’induzione statisticamente significativa nelle attività di 6b- e 16b-OHT in D e DE vs controlli (K, p<0,05) e nell’attività di 2b–OHT in D e DE vs K (p<0,05 e p<0,01, rispettivamente), confermando quanto riportato in letteratura per l’uomo (McCune et al., 2000). Tali risultati sono stati convalidati ulteriormente dall’analisi in Immunoblotting che ha evidenziato un aumento dell’espressione di CYP3A in D e D+E vs K (p<0,01 e p<0,05, rispettivamente). In un secondo esperimento, sono state determinate le attività di 6b-, 16b- e 2b-OHT in epatociti di bovino dopo 24 h di incubazione con boldenone (B), androsta-1,4-diene-3,17-dione (A) e B + A. I risultati ottenuti hanno evidenziato un trend inibitorio negli epatociti incubati con promotori di crescita rispetto a K. In particolare, le attività di 6b e 16b OHT sono state inibite in A e B vs K mentre l’attività di 2b-OHT in A vs K (p<0,05). A livello di proteina invece, non è stata riscontrata alcuna differenza statisticamente significativa nell’espressione di CYP3A (Immunoblotting). L’effetto inibitorio osservato potrebbe essere dovuto alle dosi utilizzate; un caso di effetto inibitorio/tossico di alte dosi di sostanze inducenti è riportato da Kostrubsky et al. (1999) che hanno utilizzato epatociti di uomo per studiare l’induzione del sistema citocromo P450 evidenziando la necessità di effettuare degli studi dose-risposta in un ampio range di concentrazioni delle sostanze utilizzate e di valutarne la tossicità. Nel complesso, i risultati ottenuti in questi due esperimenti hanno confermato la modulazione da parte di estrogeni, corticosteroidi ed anabolizzanti dell’espressione e la regolazione degli enzimi citocromo P450-dipendenti. Chiaramente, rimane comunque la necessità di spiegare più approfonditamente per quanto riguarda il bovino i meccanismi tramite i quali queste sostanze agiscono sia a livello pre-trascrizionale che post-trascrizionale. IV) Valutazione dell’attività di CYP1A nel fegato di Zosterisessor ophiocephalus come biomarcatore di inquinamento nella laguna di Venezia. Recentemente, è stato dimostrato che i biomarcatori (BM) sono molto utili per rilevare dei cambiamenti biologici precoci nell’inquinamento ambientale. Uno dei BM più comunemente usati nei pesci è l’induzione dell’attività di etossiresorufina-O-deetilasi (EROD) che è un indicatore dell’esposizione dell’organismo a composti potenzialmente tossici, come ad esempio i policloro-bifenili e gli idrocarburi aromatici policiclici (Burgeot et al., 1994). Di conseguenza, lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare l’attività di EROD tramite HPLC in Zosterisessor ophiocephalus, una specie bentonica che date le sue caratteristiche, può rappresentare un utile indicatore biologico dei livelli di stress ambientale presente nella Laguna di Venezia. I pesci sono stati raccolti in primavera ed in autunno in tre aree della Laguna di Venezia: Porto Marghera (PM), Valle di Brenta (VB) e Porto Canale (PC); i campioni sono stati poi suddivisi in femmine, maschi e sneakers (maschi giovani). L’analisi fattoriale ha evidenziato la significatività dei fattori sito, categoria e stagione (p<0,001) ma anche delle interazioni categoria*sito e categoria*stagione (p<0,01). Per quanto riguarda l’effetto del sito in particolare, PM possedeva valori di attività di EROD significativamente più elevati rispetto a VB e PC (p<0,01 e p<0,001, rispettivamente) e VB rispetto a PC (p<0,001). Tali risultati sembrerebbero essere in accordo con i dati disponibili relativi alla concentrazione di inquinanti organici persistenti (POP) espressa come fattore di arricchimento (EF) nei sedimenti della Laguna di Venezia, i quali indicano una contaminazione maggiore nell’area circostante a Marghera (EF>12), intermedia nei pressi di Valle di Brenta (EF=5-12) e ridotta nel territorio contiguo al sito di Porto Canale (EF=1-5; Guerzoni et al., 2004). L’effetto del sito dipendeva comunque dalla categoria di animali considerata ed in particolare sono state evidenziate delle differenze tra maschi e femmine, dovute probabilmente comunque al campione analizzato più che a differenze reali in termini di induzione. Dai risultati ottenuti, l’attività di EROD è da considerarsi un buon biomarcatore anche se, considerando la natura multifattoriale della risposta dell’individuo, è necessario l’utilizzo congiunto di più biomarcatori significativi per effettuare una valutazione accurata degli effetti dell’inquinamento nell’ecosistema acquatico. V) Messa a punto di metodi high-throughput in luminescenza per la valutazione dell’attività di CYP3A e di CYP2C nel fegato di cavallo. Nell’ultimo capitolo della tesi, sono riportati i risultati relativi agli studi di cinetica enzimatica e di inibizione chimica volti alla valutazione delle attività di CYP2C e CYP3A nel fegato di cavallo mediante l’utilizzo di saggi Glo. Lo scopo è stato quello di valutare le performance di questa tecnologia allo scopo di applicarla in studi di metabolismo e di interazioni tra farmaci. I parametri di cinetica enzimatica per le attività di CYP3A e di CYP2C sono risultati rispettivamente 14,5 ± 7,3 e 175,9 ± 16,24 μM per la Km e 0,022 ± 0,004 e 0,025 ± 0,0009 nmol/min/mg proteina per la Vmax. Chetoconazolo (inibitore di CYP3A) ha evidenziato un valore di IC50 pari a 0,035 μM, confermando quindi una buona specificità del substrato luciferina (L)-derivato utilizzato per CYP3A (L-IPA). Sulfafenazolo (inibitore di CYP2C) ha evidenziato un valore di IC50 pari a 47,2 μM, suggerendo dunque la necessità di effettuare ulteriori studi volti a verificare la specificità di substrato (L-H), ad esempio utilizzando altri inibitori selettivi per tale sottofamiglia come l’ibuprofene o il diclofenac. I metodi in luminescenza messi a punto permettono di analizzare un numero elevato di campioni in tempi brevi, di monitorare più di un’isoforma contemporaneamente nella stessa piastra e sono caratterizzati da una buona sensibilità, confermata dai valori di LOD ottenuti: 0,2 e 0,11 nM per L-H e L-IPA, rispettivamente. I risultati ottenuti dunque possono costituire un ottimo punto di partenza per poter applicare la tecnologia di tali saggi in studi relativi alle specie di interesse veterinario con vantaggi di costi e tempi di realizzazione delle analisi