BIODIVERSITY ANALYSIS TROUGH DNA BARCODING Applications in agrifood and seafood products

L’attività di ricerca, i cui risultati sono oggetto della dissertazione di dottorato, ha riguardato lo studio delle potenzialità applicative del DNA barcoding, una tecnica molecolare volta all’identificazione degli organismi sulla base dei polimorfismi di specifiche sequenze nucleotidiche localizzate nei genomi plastidiale, mitocondriale e cloroplastico. Il progetto di ricerca ha previsto l’impiego di questo approccio per il riconoscimento di specie ai fini della tracciabilità genetico-molecolare di prodotti agro-alimentari, sia di origine animale (pesci, molluschi e crostacei) che vegetale (fagiolo e vite). Inizialmente si è proceduto all’individuazione degli organismi su cui condurre l’analisi: si sono collezionate linee pure di fagiolo (Phaseolus vulgaris L.), cloni di vite (Vitis vinifera L.) e campioni di pesci, crostacei e molluschi acquistati presso famose GDO o ai mercati locali di Chioggia e Sottomarina. In particolare, per quanto concerne la scelta delle specie ittiche su cui condurre l’analisi, si è svolta un’estesa indagine di mercato con l’intento di individuare le specie maggiormente coinvolte in falsificazioni alimentari, cioè sostituzione di specie pregiate con altre di valore inferiore. Si è successivamente proceduto alla purificazione di 37 campioni di DNA genomico e alla loro caratterizzazione dal punto di vista molecolare mediante amplificazione e sequenziamento di specifici geni mitocondriali, quali cox1 (Cytochrome oxydase subunit I), 16S-rDNA (16S small ribosomal subunit RNA) e cob (cytochrome b). Una volta acquisiti questi dati, l’interrogazione di due banche dati disponibili on line, BOLD per il gene cox1 e GenBank per tutti e tre i geni, ha consentito di identificare l’origine dei campioni confermando nella maggioranza dei casi quanto dichiarato nell’etichetta di accompagnamento del prodotto alimentare. In cinque situazioni non è stato possibile stabilire con certezza l’origine del campione e questo potrebbe indicare possibili casi di sostituzione, fraudolenta o accidentale. Il DNA barcoding pertanto è risultato utile ai fini dell’identificazione di specie in tutti e tre i taxa studiati, pesci, molluschi e crostacei, e il gene cox1 si è dimostrato un ottimo target per questi scopi eccetto che in tre casi particolari, i generi Thunnus, Macruronus e Gadus. Inoltre è risultato evidente che nonostante GenBank persista come la banca dati più ricca in termini di numero di sequenze depositate, il BOLD sta rapidamente incrementando la quantità di informazioni contenute al suo interno lasciando presupporre che in breve tempo diventerà la banca dati di riferimento per studi di genetica forense e di tracciabilità genetica. Per quanto riguarda le specie vegetali, l’obiettivo era l’identificazione univoca di specie, e soprattutto delle loro varietà quando fondate su un solo genotipo (linee pure, ibridi e cloni). Nel caso di fagiolo, si sono isolati i DNA genomici da 54 varietà di Phaseolus vulgaris, 18 provenienti dal Centro America, 12 dal Sud America e 24 line pure coltivate e commercializzate in Italia, insieme con alti 6 campioni usati come fuori gruppo (Phaseolus coccineus, Phaseolus lunatus e Vigna unguiculata). Sono risultate indispensabili indagini preliminari di polimorfismi di singoli geni al fine di determinare la variabilità genetica tra le varietà e la tracciabilità genetica di singole varietà. La caratterizzazione, tramite l’amplificazione di 7 differenti regioni cloroplastiche e due nucleari seguita da un approccio fenetico, ha confermato le potenzialità della tecnica come strumento efficace per la distinzione delle specie, mentre è risultata scarsamente informativa per il riconoscimento di singole varietà. Da qui si è rivelata necessaria l’adozione di un approccio alternativo, basato sulla determinazione della composizione nucleotidica e del polimorfismo a carico di ciascun gene esaminato, che ha permesso di definire 16 aplotipi corrispondenti ad altrettanti sottogruppi varietali, ciascuno costituito da accessioni Mesoamericane o Andine insieme con le varietà Italiane. Infine l’applicazione del DNA barcoding per la distinzione di cultivar di vite ha richiesto l’abbandono dello studio del genoma cloroplastico, troppo poco variabile, a favore di quello nucleare. Si sono isolati i DNA genomici da 123 cultivar di Vitis vinifera e da altre 5 specie (V. rupestris, V. riparia, V. labrusca, V. cinerea e V. berlandieri) e si sono amplificati 4 EST ed il gene GAI1 (gibberellins insensitive-like). L’analisi bioinformatica è ancora in corso, ma risultati preliminari fanno ipotizzare l’esistenza di aplotipi cultivar-specifici che potrebbero venir impiegati in futuro per risolvere i frequenti casi di sinonimie ed omonimie diffusi all’interno di questa specie. Infine un’altra interessante applicazione da un punto di vista economico potrebbe essere l’impiego di questi aplotipi cultivar-specifici per la tracciabilità genetica dei vini e la tutela delle denominazioni controllate da casi di falsificazione e concorrenza sleale.