TWO TOPICS OF PHYSIOPATHOLOGICAL INTEREST IN MITOCHONDRIAL RESEARCH: INNER MEMBRANE CHANNELS AND MITOCHONDRIOTROPIC REDOX-ACTIVE COMPOUNDS

Il gruppo presso cui ho svolto il mio corso di dottorato si interessa di vari aspetti della funzionalità mitocondriale. I progetti che ho seguito riguardano due ambiti molto diversi tra loro; tuttavia in entrambi i casi si tratta di studi il cui obiettivo a lungo termine è l’individuazione di composti potenzialmente utili per un’azione antitumorale a livello mitocondriale. Uno di questi progetti riguarda i canali del potassio presenti nella membrana mitocondriale interna. Negli ultimi anni ne sono stati individuati diversi. Oltre ad aver un ruolo nella regolazione di processi e parametri mitocondriali questi canali son risultati interessanti per il loro coinvolgimento in altri aspetti della fisiologia cellulare. Due di questi sembrano aver un ruolo nella protezione dal danno ischemico (precondizionamento), mentre un recente studio svolto dal nostro gruppo in collaborazione con un gruppo tedesco ha messo in evidenza come un terzo, il mtKV1.3, svolga un ruolo importante nell’apoptosi mediata da Bax in linfociti. Da qui l’interesse da parte nostra verso quest’ultimo canale. Ho verificato se il mtKV1.3 fosse presente nei mitocondri non solo dei linfociti T, dove è stato individuato inizialmente, ma anche in alcune altre linee tumorali. Sono riuscito finora ad individuarlo in due linee umane (PC3 e MCF7) (Gulbins et al., 2010 - Cap. 1). Ho successivamente indagato se l’inibizione del canale potesse indurre morte cellulare in tali linee. Ciò sarebbe di notevole interesse nello sviluppo di nuovi chemioterapici. Tuttavia dai risultati ottenuti l’utilizzo di inibitori specifici del canale nelle differenti linee non ha mostrato effetti rilevanti di induzione di morte cellulare (Cap. 2). Sempre nell’ambito di questo progetto abbiamo individuato un altro canale mitocondriale: il mtKCa3.1 che abbiamo osservato nei mitocondri di una linea tumorale del colon umana (HCT116) sia mediante patch-clamp che Western blot. (De Marchi et al., 2009 - Cap. 3). Ho poi verificato se la sua inibizione potesse essere citotossica o almeno citostatica, tuttavia anche in questo caso non abbiamo ottenuto una risposta positiva. Ho verificato la presenza o meno del canale anche in due altre linee tumorali del colon (C26 e Caco2) per comprendere se fosse un canale espresso in modo tumore-specifico procedendo successivamente a confronti con cellule non tumorali, tuttavia in ambedue i casi il canale è risultato presente solo nella plasma membrana (Sassi et al., 2009 - Cap 4). L’altro progetto da me intrapreso riguarda lo sfruttamento farmacologico dei polifenoli vegetali presenti in molti cibi e bevande. Una notevole letteratura mostra come tali composti possiedano interessanti proprietà biologiche che potrebbero esser utili in diversi ambiti, come la protezione cardiovascolare o dalla neurodegenerazione, oppure nel prevenire l’insorgere e nell’inibire la crescita di molti tipi di cancro. Questi composti dalle interessanti potenzialità trovano una notevole difficoltà d’utilizzo a causa della loro scarsa biodisponibilità. A priori, un modo per ovviare a questo problema è accumulare tali composti in un’opportuna sede d’azione. Una scelta ovvia è il mitocondrio, dato che i polifenoli sono molecole redox-attive (la cui attività può essere anti- o pro-ossidante in base a differenti condizioni come pH, presenza di Fe2+/3+ o Cu+/2+ e concentrazione del composto) e che i mitocondri son il principale sito di produzione dei radicali, oltre ad esser coinvolti nei processi di morte cellulare. Questi composti mitocondriotropici potrebbero aver una rilevanza biomedica sia che dimostrino un’attività anti-ossidante/citoprotettiva sia invece che si comportino da pro-ossidanti citotossici. Il nostro gruppo ha quindi sintetizzato alcuni derivati di quercitina e resveratrolo - due polifenoli particolarmente studiati presi a modello - in grado di accumularsi nei mitocondri. Questo grazie alla funzionalizzazione con un gruppo trifenilfosfonio (TPP+), un catione lipofilico che può diffondere attraverso le membrane biologiche e accumularsi in regioni a potenziale negativo, quali la matrice mitocondriale e il citoplasma. Abbiamo verificato che questi derivati si accumulassero effettivamente nei mitocondri (Mattarei et al, 2008 - Cap. 5; Biasutto et al, 2008 – Cap. 6). Una prima indagine sugli effetti biologici di questi nuovi composti è stata condotta con due derivati della quercetina (Q3BTPI, QTA3BTPI). Abbiamo osservato come questi composti con mitocondri isolati siano potenziali co-induttori della transizione di permeabilità mitocondriale (MPT), nonché inibitori della respirazione e dell’ATP sintasi mitocondriale. Osservazioni a livello cellulare mostrano una depolarizzazione mitocondriale indipendente dalla MPT indotta da entrambi i composti e un modesto aumento della produzione cellulare di ROS da parte della QTA3BTPI (Biasutto et al., 2010 – Cap. 7). Ho ampliato lo studio per valutare la possibile azione citotossica/citostatica su linee cellulari tumorali (C26) e non (MEF) dei vari composti mitocondriotropici. Ho anche indagato come tali composti influiscano sull’attività mitocondriale di un’altra linea cellulare tumorale (Jurkat). I risultati di esperimenti di vitalità cellulare mostrano come diversi composti mitocondriotropici, somministrati a concentrazioni in ambito micromolare, possano aver un’ attività citotossica/citostatica su cellule a crescita veloce, mentre il loro effetto su cellule non tumorali è molto modesto se esse hanno crescita lenta. I risultati iniziali di uno studio meccanicistico hanno evidenziato come concentrazioni relativamente elevate (nell’ambito di 10-5 M) di questi composti possano causare alterazioni morfologiche, depolarizzazione mitocondriale e generazione di specie radicaliche (Cap. 8).