SVILUPPO DI SISTEMI MICROPARTICELLARI PER IL RILASCIO INTRAARTICOLARE PROLUNGATO DI CITOCHINE ANTIINFIAMMATORIE PER LA TERAPIA DELLE PATOLOGIE REUMATICHE

Scopo: Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare un sistema a rilascio prolungato per il delivery di farmaci biotecnologici per il trattamento intraarticolare (IA) delle patologie infiammatorie croniche come l’artrite reumatoide e l’osteoartrosi. Lo studio è stato focalizzato sulla preparazione di microparticelle costituite da polimeri biodegradabili e biocompatibili (PLGA, PLA e derivati dell’acido ialuronico). IL-1Ra umano ricombinante (anakinra) è stato utilizzato come modello di farmaco biotecnologico ad azione antiinfiammatoria per il suo ruolo fondamentale di antagonista del recettore per l’IL-1, citochina della quale è noto il ruolo chiave proinfiammatorio nelle patologie reumatiche croniche. Introduzione: Le microparticelle polimeriche sono state ampiamente studiate come sistemi di drug delivery per i farmaci biotecnologici. Questo tipo di formulazioni può garantire la stabilità nel tempo del farmaco e un lento rilascio che consente di ottimizzare il protocollo terapeutico. Tuttavia, la formulazione di proteine è solitamente complicata dalla scarsa stabilità di queste fragili molecole che vanno incontro a denaturazione ed inattivazione se sottoposte a condizioni operative drastiche. La messa a punto di opportune procedure che conservino l’attività delle proteine è essenziale per ottenere prodotti efficaci. Materiali e Metodi: La preparazione di microparticelle a base di polimeri biodegradabili è stata studiata utilizzando diverse tecniche: nanoprecipitazione, emulsione ed estrazione della fase interna, emulsione ed evaporazione, doppia emulsione ed evaporazione, spray drying. Varie combinazioni di eccipienti (PLA, PLGA, PLGA-H, PEG, tristearina, acido ialuronico e derivati, Polossamero, fosfatidilcolina) e diverse condizioni operative (concentrazione del polimero e della proteina, settaggio della strumentazione ecc) sono state valutate al fine di evidenziare i principali parametri critici che determinano le proprietà chimico-fisiche della preparazione. I prodotti sono stati caratterizzati per le loro proprietà morfologiche e dimensionali, e sono stati valutati il caricamento e il rilascio del farmaco. Il rilascio in vitro di IL-1RA dalle microparticelle in tampone fisiologico o liquido sinoviale è stato valutato utilizzando tecniche come RP-HPLC ed ELISA. La cinetica di rilascio in vivo di IL-1Ra dalle microsfere è stata valutata mediante metodi ELISA. Sono stati effettuati degli studi di efficacia terapeutica della formulazione utilizzando un modello animale di artrite da collagene (C.I.A.); i diversi gruppi di animali sono stati trattati con diverse dosi di microsfere o di Kineret, e con frequenze diverse di somministrazione. Sono stati valutati il paw score, il peso, diametro dell’articolazione della caviglia e la tumefazione del femore. Risultati: Sono stati ottenute tipologie differenti di formulazioni utilizzando diversi tipi di polimeri biocompatibili, diversi rapporti tra i componenti, diverse concentrazioni di polimero e differenti procedure di preparazione. La tecnica di spray drying è risultata la più efficace in termini di resa, di caricamento del farmaco e di polidispersività dimensionale. La preparazione mediante spray drying di microsfere a partire da sospensioni di liofilizzati di IL-1Ra/PEG in soluzioni organiche di PLA o PLGA ha permesso l’ottenimento di microparticelle con dimensioni comprese tra 1 e 30m, compatibili con l’uso iniettabile. Si è verificato che i principali parametri critici che possono influenzare le proprietà biofarmaceutiche delle formulazioni sono: peso molecolare del PEG utilizzato e rapporto PEG/IL-1Ra nel liofilizzato, concentrazione di PLA o PLGA nel solvente organico, tipo di PLGA e velocità di alimentazione dell’ugello dello strumento. L’ottimizzazione di questi parametri ha permesso di ottenere microsfere di dimensioni adatte all’iniezione intraarticolare (2-15m) e con un elevata efficienza di caricamento del farmaco (50-70%); queste microparticelle sono costituite da 75% p/p di PLGA (in soluzione organica al 4%), 5% p/p di Epikuron 200SH (fosfatidilcolina), 10% p/p di PEG 5kDa e 10% p/p di IL-1Ra. Gli studi di farmacocinetica in topi Balb/c hanno evidenziato che, negli animali trattati con microsfere caricate con citochina, la concentrazione plasmatica di IL-1Ra decresce molto più lentamente che negli animali trattati con il prodotto commerciale Kineret® (anakinra); dopo 24h dalla somministrazione di Kineret, infatti, non vi è più traccia rilevabile di IL-1Ra nel plasma, mentre, dopo somministrazione di microsfere caricate con IL-1Ra, si rileva presenza di citochina per tempi superiori alle 48h. L’utilizzo del modello animale di artrite sperimentale ha permesso di valutare l’efficacia terapeutica delle microsfere: la somministrazione di microsfere caricate con IL-1Ra consente di ridurre la frequenza di trattamento ottenendo risultati confrontabili ad una iniezione giornaliera di Kineret. Conclusione: Il metodo di sospensione e spray drying sviluppato è adatto all’ottenimento di sistemi per il rilascio prolungato di prodotti biotecnologici come citochine, anticorpi monoclonali e proteine di fusione. Le caratteristiche chimico-fisiche dei prodotti possono essere modificate e adattate allo scopo desiderato variando le condizioni di processo e la composizione della formulazione.