Tolerance to biocides, persistence and nanoparticles: a molecular view in Listeria monocytogenes and Salmonella enterica.

L’elevata distribuzione a livello mondiale di batteri resistenti e multi resistenti agli antibiotici è uno dei più importanti problemi che il mondo scientifico stia affrontando. La diffusione di ceppi batterici resistenti ai composti usati nella pratica clinica e nella decontaminazione ambientale è un pericolo per la salute pubblica. Le infezioni causate da batteri multi resistenti hanno un importante impatto sulla produttività e sui costi del servizio sanitario. Lo scopo di questo progetto è stato quello di approfondire il problema, valutando la pressione selettiva per lo sviluppo di tolleranze in Listeria monocytogenes data dall’uso e dall’uso improprio dei biocidi usati negli impianti di trasformazione della carne; studiando la distribuzione dei determinanti genetici di resistenza e persistenza nella popolazione di Salmonella; e valutando le possibili applicazioni future di composti innovativi, come le nano particelle, per il loro effetto antimicrobico sui patogeni di origine alimentare. Nell’Articolo I lo scenario reale delle industrie di trasformazione della carne di suino è stato studiato valutando l’uso dei biocidi per la decontaminazione ambientale. Sono state valutate cinque industrie di lavorazione della carne secondo la loro applicazione delle procedure di pulizia e disinfezione. È stata effettuata una serie di campioni su diverse superfici, sia prima che dopo le procedure di pulizia e disinfezione, che sono stati testati per la presenza di Listeria monocytogenes. Usa serie di isolati è stata selezionata per essere tipizzata secondo un protocollo di Multi Locus Sequence Type (MLST). La resistenza fenotipica agli antibiotici è stata valutata usando il metodo di Minimum Inhibitory Concentration (MIC) e sono stati ricercati con PCR i determinanti genetici di resistenza. I risultati hanno presentato un alto grado di similarità tra i ceppi raccolti. Per valutare la risposta batterica allo stress, è stata effettuata l’analisi dell’espressione genetica di due ceppi identici da un punto di vista genetico (secondo il profilo di Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus, ERIC), che sono stati raccolti sulla stessa superficie prima e dopo le procedure di pulizia e disinfezione. I ceppi sono stati incubati con diverse concentrazioni di un sale d’ammonio quaternario (QAC) per 24 ore. L’RNA è stato estratto a differenti time point, per essere poi retro trascritto per la valutazione dell’espressione di due geni codificanti per due pompe aspecifiche di efflusso (mdrL e lde). Il gene lde è stato espresso, durante lo stress antimicrobico, con una tendenza dose-dipendente, dal ceppo isolato prima delle procedure di pulizia e disinfezione; invece il ceppo isolato dopo le procedure di pulizia e disinfezione ha presentato un’espressione di lde bassa e costante, con un leggero incremento in presenza della massima concentrazione di disinfettante. Per quanto riguarda mdrL, la sua espressione è stata diversa da quella di lde. L’espressione di mdrL è stata simile tra i due ceppi: una massima espressione senza lo stress del biocida, una forte riduzione con lo stress sub inibitorio e un leggero aumento durante l’esposizione alla massima concentrazione. Quindi si è potuto notare come lde sembri svolgere una funzione protettiva per il ruolo che ha esercitato nel ceppo isolato prima delle operazioni di pulizia e disinfezione. Il ceppo isolato dopo le procedure ha espresso lde solo sotto forte stress antimicrobico, mettendo in evidenza il ruolo del gene sotto stress ambientale e le diverse caratteristiche di tolleranza tra i due ceppi. Invece il gene mdrL è sembrato non presentare una particolare induzione all’espressione sotto lo stress antimicrobico testato. Infine, questo articolo evidenzia l’importanza dell’applicazione efficiente delle procedure di pulizia e disinfezione per evitare la selezione nell’ambiente di ceppi batterici resistenti. Nell’Articolo II è stata studiata la distribuzione di moduli Tossina- Antitossina (TA) e i profili di antibiotico resistenza in diverse specie di Salmonella. È stata testata una selezione dei serovar più prevalenti (S. Enteritidis, S. Typhimurium, and S. 4,[5],12:i:-, S. Gallinarum) e più rari (S. Tennessee, S. Lawndale and S. Alachua) che circolano a livello europeo. I moduli TA predispongono l’adattabilità batterica per la sopravvivenza in condizioni ambientali non favorevoli, contribuendo all’induzione di quiescenza cellulare come risposta allo stress, dando così una protezione ai batteri che diventano meno sensibili ad ambienti sfavorevoli. I moduli TA investigati sono stati vapBC e ccdAB, rappresentanti dei moduli TA di tipo II (in cui sia tossina che antitossina sono proteine). In questo studio, è stata osservata la prevalenza costitutiva del gene vapBC in tutti i ceppi testati, mentre il gene ccdAB è stato ritrovato solo nei serovar più prevalenti e non in quelli rari. I ceppi più comuni hanno presentato un profilo di multi resistenza agli antibiotici, mentre i ceppi rari non hanno mostrato particolari resistenze agli antibiotici. La presenza di entrambi i moduli TA nei ceppi più prevalenti rappresenta un vantaggio importante che potrebbe contribuire al successo della loro distribuzione. Inoltre è stata osservata, in seguito al sequenziamento dell’amplicone, una mutazione puntiforme nel gene ccdAB. Tale mutazione inattiva la tossina CcdB, bloccando l’effetto di segregationa killing del modulo. Quindi, mancando tale meccanismo di selezione del gene, si rende evidente la possibilità che il modulo TA sia importante per la probabile insorgenza di ceppi persistenti nella popolazione batterica. Nell’Articolo III è stato studiato in vitro l’effetto antimicrobico di un nuovo composto su Listeria monocytogenes. Le nano particelle di argento (AgNPs) sono state usate a diverse concentrazioni contro una collezione di ceppi di Listeria monocytogenes valutandone l’efficacia a diversi tempi di incubazione. I nano materiali sono interessanti composti per quanto riguarda la scoperta di nuovi agenti attivi contro i batteri patogeni. Le piccole dimensioni delle nano particelle le rendono utilizzabili per molti scopi, in quanto presentano diverse caratteristiche chimico-fisiche rispetto al materiale nella forma normale. In questo studio, l’effetto delle nano particelle di argento contro un batterio Gram positivo è stato valutato in parallelo all’effetto esercitato dal nitrato d’argento. L’argento nitrato ha esercitato un suo effetto inibitore precoce, presentando inibizione batterica dopo 4 ore di incubazione. Invece le nano particelle di argento hanno esercitato il loro effetto inibitore dopo 24 ore di incubazione. Per comprendere meglio questa tendenza è stato effettuato un test di rilascio ionico su entrambi i composti. Il rilascio degli ioni d’argento è risultato essere sovrapponibile all’effetto inibitorio dei due composti, in quanto ad alto rilascio ionico è corrisposta un’alta inibizione batterica. Per questo motivo è stata supposta una dipendenza di efficacia tra tempo di risposta e tempo di rilascio ionico. Le possibili applicazioni delle nano particelle potrebbero consistere nello sfruttare l’effetto antimicrobico ritardato per mantenere bassa la popolazione batterica durante i periodi di lunga conservazione. In conclusione, durante il progetto di dottorato sono stati studiati diversi aspetti dell’adattabilità dei patogeni di origine alimentare durante una pressione selettiva ambientale; questo ha portato alla stesura di tre articoli scientifici che approfondiscono l’argomento, mettendo in luce anche possibili strategie di azione verso tale sfida.