Utilità della tecnica denaturing high performance liquid chromatography per la diagnosi di deficit di mevalonato chinasi nelle febbri periodiche di sospetta natura autoinfiammatoria

SCOPO DEL LAVORO La Mevalonate Kinase Deficency (MKD), già nota come sindrome da Iper IgD (HIDS), è una rara malattia autoinfiammatoria di tipo autosomico recessivo caratterizzata da febbre ricorrente e disturbi muscoloscheletrici. La MKD è dovuta a mutazioni del gene mvk, mappato sul cromosoma 12q24, il quale codifica per l’enzima mevalonato chinasi (MK); polimorfismi nel gene mvk sono la causa di un’alterata attività enzimatica di MK. L’individuazione della mutazione genica della mevalonato chinasi ha reso l’indagine genetica indispensabile per la diagnosi, soprattutto in pazienti con valori sierici di IgD normali, tuttavia il sequenziamento dell’intera regione codificante è costoso e la determinazione di mutazioni può essere resa più efficiente utilizzando tecniche di pre-screening in grado di identificare l’esone mutato. In questo studio è stata effettuata un’indagine genetica utilizzando l’analisi in DHPLC come tecnica di pre-screening per identificare le alterazioni nella regione codificante del gene mvk in pazienti con sospetta sindrome autoinfiammatoria. MATERIALI E METODI: A partire da gennaio 2007 sono stati presi in esame 19 pazienti (età media 33 anni, range 13 – 61 anni) seguiti presso la Cattedra e UOC di Reumatologia dell’Università di Padova per febbri ricorrenti non imputabili ad infezioni o a malattie autoimmuni e compatibili con sospetta MKD e 10 controlli sani. In ogni paziente è stato effettuato il dosaggio delle IgD nel siero. L’analisi del DNA, estratto da linfociti del sangue periferico, è stata effettuata mediante un protocollo di amplificazione per frammenti di 210-250 bp messo a punto da noi stessi, utilizzando primers specifici per le sequenze dei 10 esoni codificanti del gene mvk. I prodotti di amplificazione sono stati analizzati mediante DHPLC utilizzando il sistema Wave® Fragment Analysis (Transgenomic, Omaha, NE, USA). Le temperature di melting (Tm) sono state calcolate con Navigator Software 1.7.0 (Transgenomic). Le sequenze degli stessi frammenti amplificati sono state determinate mediante l’uso di un sequenziatore automatico ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (APPLIED BIOSYSTEMS, USA). RISULTATI: I valori sierici di IgD erano normali (<100 mg/L) in 14/19 pazienti. Nessun campione di controllo presentava alterazioni dei profili DHPLC e delle sequenze. Dodici dei 19 pazienti esaminati presentavano almeno un profilo di DHPLC alterato e i dati sono stati confermati con il sequenziamento. Sono state evidenziate le mutazioni S52N (paziente 2-13-15), D170D e c.632-18A>G (paziente 4-5-6-10-12-17-19), S135S (pz 13-16) c.78+61A>G (pz 6-11-19), c.885+24G>A (pz 6-19) già descritte in letteratura e nel database INFEVERS (http://fmf.igh.cnrs.fr/infevers). Lo screening con DHPLC ha permesso di ottenere i risultati in minor tempo (10 ore / paziente) e con costi inferiori (40 euro / paziente) rispetto alla tecnica di sequenziamento diretto (tempo: 25 ore / paziente , costi: 150 euro / paziente). CONCLUSIONI: Un elevato livello sierico di IgD non rappresenta più un marker per fare diagnosi di MKD, come già riportato in letteratura. La DHPLC è una tecnica capace di effettuare uno screening rapido e a basso costo nell’analisi di mutazioni in pazienti con sospetta sindrome autoinfiammatoria legata al gene mvk. Tuttavia, essendo una tecnica di analisi indiretta, è necessario considerare che la DHPLC aumenta l’efficienza dell’analisi ma non la sua sensibilità in quanto è in grado di evidenziare un polimorfismo di sequenza ma non la sua posizione. Sette pazienti della nostra coorte sono risultati portatori delle varianti alleliche D170D e c.632-18A>G; tale evento suggerisce che questi SNP potrebbero essere in linkage disequilibrium e che tali mutazioni potrebbero indurre una diminuzione nell’attività della MK predisponendo quindi alla MKD.