Origine e regolazione del pool mitocondriale dei deossinucleotidi guaninici

Il corretto bilanciamento del pool dei deossinucleotidi è importante per la replicazione del DNA nucleare e di quello mitocondriale. Mutazioni a carico del DNA del mitocondrio o di fattori necessari alla sua replicazione ed alla sua stabilità provocano l’insorgenza di patologie mitocondriali. Il fenotipo dal punto di vista molecolare è una disfunzione della catena respiratoria, con una ridotta produzione di energia da parte del mitocondrio. Per queste ragioni, i fenotipi clinici osservati nei pazienti affetti da queste patologie coinvolgono organi e tessuti ad alta richiesta energetica, come il fegato, il cervello, e i muscoli scheletrici. Una classe di queste patologie è quella delle sindromi da deplezione del DNA mitocondriale (MDS), nella cui patogenesi sono coinvolte anche mutazioni a carico di geni responsabili della sintesi dei dNTP all’interno della cellula. Tra questi vi sono i geni per la timidina fosforilasi (TP), la timidina chinasi 2 mitocondriale (TK2), la deossiguanosina chinasi (dGK) e un’isoforma della subunità minore della ribonucleotide reduttasi p53 dipendente (p53R2).La deossiguanosina chinasi è uno delle due deossinucleoside chinasi della via mitocondriale di recupero dei dNTP. In particolare, essa fosforila la deossiguanosina, la deossiinosina, la deossiadenosina, e la deossicitidina, oltre a diversi analoghi nucleosidici. La deossiguanosina chinasi è codificata dal gene DGUOK, localizzato nel genoma nucleare, ed è un omodimero costituito da due monomeri di 28 kDa ciascuno. Finora lo studio sul metabolismo dei deossinucleotidi si era concentrato principalmente sul pool del dTTP, il quale è più facile da analizzare visto che il suo precursore timidina viene utilizzato solamente all’interno dle pool dei deossinucleotidi, dalla timidina chinasi 1 nel citosol e dalla timidina chinasi 2 nel mitocondrio. Lo studio del pool del dGTP, invece, è più complesso in quanto il suo precursore, la deossiguanosina, può essere fosforilata nel citosol dalla deossicitidina chinasi, e nel mitocondrio dalla deossiguanosina chinasi, ma può anche essere velocemente degradata a guanina nel citosol, dalla fosforilasi dei nucleosidi purinici. La base viene poi riciclata dall’enzima ipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasi ed incorporata nel pool dei ribonucleotidi e nell’RNA. Per poter seguire l’incorporazione della deossiguanosina nel dGTP attraverso la sola via di recupero abbiamo dovuto inibire con l’Immucillina H la degradazione citosolica da parte della fosforilasi dei nucleosidi purinici, ed utilizzare cellule mutanti nell’enzima ipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasi, così da evitare il riciclo della guanina nel pool dei ribonucleotidi. Solamente in queste condizioni è stato possibile seguire l’incorporazione del precursore nei pool del dGTP e quindi nel DNA. il pool citosolico e mitocondriale del dGTP comunicano e si scambiano nucleotidi. É stato osservato un movimento bidirezionale di deossinucleotidi dal mitocondrio verso il citosol, e viceversa. Questo scambio favorisce l’instaurarsi di un equilibrio dinamico tra i due compartimenti, determinato dalla continua sintesi di dGTP e dalla incorporazione nel DNA oppure dalla sua degradazione ed eliminazione. In esperimenti di pulse e chase abbiamo osservato che il pool del dGTP ha un turnover molto rapido che comporta una completa perdita in pochi minuti della radioattività incorporata nel pool citosolico e mitocondriale.Abbiamo anche valutato gli effetti dell’inibizione della sintesi del DNA nucleare attraverso l’aggiunta di afidicolina e dell’inibizione della sintesi de novo tramite trattamento con l’idrossiurea, inibitore specifico della ribonucleotide reduttasi. Gli esperimenti con afidicolina hanno dimostrato che nonostante il dGTP non venga incorporato nel DNA esso non si accumula nel pool ma viene degradato ed eliminato velocemente. Nel caso invece dell’idrossiurea, l’inibizione della ribonucleotide reduttasi provoca un accumulo di radioattività nei deossinucleotidi della guanina nel citosol dovuta ad una riduzione del turnover del dGTP. Le informazioni sugli scambi tra citosol e mitocondri e sull’importanza della sintesi de novo per il rifornimento dei dNTP mitocondriali ricavte da questi esperimenti con la deossiguanosina sono in accordo con quelle raccolte in precedenza per il pool del dTTP, così da poter concludere che esse rappresentano leggi generali che regolano la sintesi e regolazione dei pool dei dNTP e sono valide per tutti e quattro i deossinucleotidi.