Kinetics and regulation of HTLV-1 gene expression

RIASSUNTO Il virus T-linfotropico umano di tipo 1 (HTLV-1) è l’agente eziologico di due distinte patologie, la leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL, adult T-cell leukemia/lymphoma), un'aggressiva neoplasia a carico dei linfociti T CD4+ maturi, e della paraparesi spastica tropicale/mielopatia associata ad HTLV-1 (TSP/HAM, tropical spastic paraparesis/HTLV-1-associated myelopathy), una patologia degenerativa del sistema nervoso centrale. La strategia di espressione genica di HTLV-1, caratterizzata dalla produzione di trascritti a partire da promotori localizzati sia nel filamento positivo che in quello negativo del genoma virale, da splicing alternativo e da traduzione bicistronica, incrementa notevolmente la capacità codificante di HTLV-1, con la conseguente espressione di numerosi geni regolatori ed accessori (Tax, Rex, p12, p13, p21rex, p30tof e HBZ) in aggiunta alle proteine strutturali e agli enzimi associati al virione, comuni a tutti i retrovirus (Gag, Pro, Pol ed Env). Nonostante oltre 30 anni di studi, diversi aspetti chiave del ciclo vitale di HTLV-1 e della sua patogenicità rimangono tutt'oggi non noti. In particolare, non è ancora chiaro se l'espressione genica di HTLV-1 sia caratterizzata da stadi di latenza, se i diversi geni virali presentino cinetiche di espressione distinte e quali meccanismi molecolari possano controllare questi fenomeni. Gli studi descritti nella presente tesi sono stati mirati a comprendere questi aspetti della regolazione genica di HTLV-1. A questo scopo abbiamo sviluppato un protocollo di Real Time RT-PCR associato all'impiego di primer specifici per le diverse giunzioni di splicing al fine di quantificare i diversi trascritti codificati da HTLV-1 e di analizzarne le cinetiche di espressione sia in cellule mononucleate di sangue periferico isolate da individui infettati con HTLV-1, che in cellule trasfettate con cloni molecolari di HTLV-1. I risultati ottenuti indicano che l'espressione degli mRNA codificati da HTLV-1 segue una precisa cinetica dopo riattivazione dell'espressione virale: l'mRNA codificante le proteine regolatrici Tax e Rex agisce come trascritto precoce che precede l'espressione degli altri geni virali. Sebbene sia comunemente accettato che Rex eserciti la sua funzione a livello post-trascrizionale controllando l'esporto nucleare e la stabilità degli mRNA che codificano le proteine associate al virione, fino ad oggi non è mai stata investigata la Rex-dipendenza dei trascritti p12, p13, p21rex, p30tof e hbz. Al fine di testare se le cinetiche di espressione genica di HTLV-1 osservate potessero dipendere dalla funzione di Rex e al fine di determinare la Rex-dipendenza dei singoli mRNA virali, abbiamo generato un clone molecolare di HTLV-1 knock-out per Rex e analizzato la compartimentalizzazione nucleo-citoplasmatica dei trascritti virali. I risultati ottenuti hanno dimostrato la stretta Rex-dipendenza delle cinetiche di espressione a "due fasi" ed hanno rivelato una forte ritenzione nucleare degli mRNA codificanti HBZ, supportando la loro funzione come trascritti non codificanti. Inoltre, i risultati ottenuti hanno dimostrato che la responsività a Rex dei differenti mRNA virali potrebbe essere determinata dalla presenza di una sequenza regolatoria di 72 nucleotidi che agisce in cis, localizzata a monte dell'esone 3. Infine, analisi matematiche hanno sottolineato l'importanza di un ritardo temporale tra le funzioni di Tax e di Rex, supportata dall'evidenza sperimentale di un ritardo nell'accumulo e di un'emivita più prolungata di Rex rispetto a Tax. I dati ottenuti in questo studio forniscono l'evidenza di una regolazione temporale dell'espressione genica di HTLV-1, rivelano una differente compartimentalizzazione degli mRNA virali e offrono una possibile spiegazione di un paradosso ancora irrisolto della regolazione di HTLV-1, ovvero la differente Rex-dipendenza dei trascritti virali, nonostante la presenza della sequenza responsiva a Rex (RxRE, Rex-responsive element) nella regione 3' non tradotta di tutti i trascritti virali.