Study of the mechanism of action of botulinum neurotoxins to develop inhibitors and to improve their pharmacological application

Le neurotossine botuliniche (BoNTs) sono esotossine batteriche, agenti eziologici del botulismo. In base alla diversa antigenicità si possono dividere in sette sierotipi principali (BoNT/A-/G) che comprendono ulteriori sottotipi (BoNT/A1, BoNT/A2 ecc.). Presentano tutte tropismo specifico per la giunzione neuromuscolare dove esercitano un’azione neuroparalizzante. Nonostante la sequenza amminoacidica eterogenea, dal punto di vista strutturale e funzionale le BoNTs appaiono altamente conservate: sono composte da due catene polipeptidiche, una pesante di 100 kDa (H) e una leggera di 50 kDa (L), unite da un unico, ma fondamentale, ponte disolfuro. Il C-terminale (HC, 50 kDa) e l’N-terminale (HN, 50 kDa) di H costituiscono una sofisticata macchina molecolare che media sia il legame neurospecifico della molecola ai terminali nervosi periferici che la traslocazione di L nel citoplasma dei motoneuroni. L è una proteasi zinco-dipendente che idrolizza in modo specifico le proteine SNARE (SNAP-25 (synaptosomal-associated protein of 25 kDa), VAMP (vesicle-associated membrane protein) and Stx (syntaxin)), tre proteine che costituiscono il nucleo della macchina molecolare, il cosiddetto “SNARE complex”, che media la fusione delle vescicole sinaptiche (SV) con la membrana presinaptica permettendo il rilascio di neurotrasmettitore. Il taglio di una di queste importanti proteine provoca una riduzione nella funzionalità del complesso e quindi un blocco della neuroesocitosi: ciò determina la paralisi flaccida tipica del botulismo. I pazienti possono morire di insufficienza respiratoria ma, se le funzioni vitali vengono sostenute, essi recuperano completamente la mobilità in quanto la neuroparalisi è reversibile. Il meccanismo d’azione delle BoNTs può essere riassunto in cinque fasi fondamentali: 1) riconoscimento specifico e legame al terminale sinaptico, 2) internalizzazione tramite il riciclo delle SV, 3) traslocazione pH-dipendente di L nel citoplasma 4) riduzione del ponte disolfuro intercatena e 5) idrolisi delle proteine SNARE. In particolare, la BoNT/A e BoNT/E agiscono sulla SNAP-25, mentre BoNT/B, /D, /F e /G idrolizzano la VAMP. La BoNT/C è unica perché taglia sia SNAP-25 che la proteina sintaxina. Le BoNTs sono le sostanze più velenose note, classificate dal Centro per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie (CDC) come agenti in categoria A, cioè tossine potenzialmente utilizzabili come armi biologiche. Attualmente non esiste nessun vaccino approvato per l’uso umano e l'unico trattamento disponibile consiste nell'immunizzazione passiva con antisieri prodotti per contrastare i sette sierotipi principali e di conseguenza variabilmente reattivi nei confronti dei sottotipi. Questa situazione ha promosso un'intensa ricerca per sviluppare nuove antitossine. Tuttavia, allo stesso tempo, la loro neurospecificità e la reversibilità della paralisi rendono le BoNTs degli agenti terapeutici di prima scelta per il trattamento di un’ampia varietà di malattie umane caratterizzate da iperattività dei terminali nervosi periferici. Considerando questa dicotomia, il mio progetto di dottorato si può dividere in due parti principali aventi lo scopo di: i) sviluppare pan-inibitori in grado di prevenire/trattare il botulismo e ii) capire meglio il funzionamento delle BoNTs in vivo per migliorare e ampliare l'uso di queste molecole in terapia. i) Considerando il meccanismo d’intossicazione delle BoNTs, uno step fondamentale è la riduzione del ponte disolfuro intercatena, senza la quale L rimane attaccata a H e non può esercitare la sua attività catalitica. Utilizzando un approccio farmacologico ho dimostrato che il sistema Tioredossina-Tioredossina Reduttasi (Trx-TrxR) è il principale responsabile della riduzione per tutti i sierotipi di tossina botulinica e che inibitori di questa coppia redox producono una sostanziale protezione dall’intossicazione sia in vitro che in vivo in un modello che ricapitola il botulismo. Questo risultato è importante perché è il primo che mostra che sierotipi diversi di BoNTs possono essere inibiti da un'unica molecola (pan-inibitore) che agisce sul meccanismo d’azione comune. Un altro aspetto importante nella tossicità di queste neurotossine è il loro traffico all'interno del terminale nervoso. Questo potrebbe essere un altro target razionale. Recentemente, è stato riportato che il composto chimico EGA inibisce agenti patogeni o tossine che necessitano del passaggio attraverso compartimenti acidi (endosomi) per poter penetrare nel citoplasma di cellule bersaglio. Dal momento che anche le BoNTs necessitano di condizioni simili perché avvenga la traslocazione di L nel citoplasma, ho saggiato l’effetto di questa molecola sull’azione delle BoNTs. Consistentemente, ho trovato che EGA inibisce significativamente l’attività neurotossica della BoNT/A, BoNT/B e BoNT/D in vitro e in vivo. Sono stati scelti questi tre sierotipi perché sono quelli più comunemente associati al botulismo umano (BoNT/A e /B) ed animale (BoNT/D). È interessante notare come nessuno degli steps del meccanismo d’azione sia direttamente inibito dalla molecola: ciò è compatibile con la possibilità che EGA interferisca con il traffico delle BoNTs all’interno del terminale nervoso ostacolando il raggiungimento del compartimento acido essenziale per la traslocazione di L. Complessivamente, questi studi mostrano come l’attività delle BoNTs possa essere significativamente inibita, indipendentemente dalle loro differenze antigeniche, usando molecole che agiscano su steps comuni del meccanismo d’azione. Questi inibitori rappresentano lead compounds per lo sviluppo di farmaci capaci di prevenire il botulismo. ii) Le BoNTs sono agenti terapeutici di successo. Nonostante il loro impiego sia quasi esclusivamente limitato alle BoNT/A e BoNT/B, dati recenti ottenuti su volontari umani suggeriscono che la BoNT/C possa essere utilizzata per trattare individui non rispondenti a BoNT/A e BoNT/B con risultati farmacologici altrettanto efficaci. Tuttavia, al momento ci sono poche conoscenze riguardo al meccanismo con il quale la BoNT/C paralizza i terminali nervosi periferici in vivo: infatti, a differenza di tutti gli altri sierotipi, la BoNT/C è l'unica che idrolizza due substrati, SNAP-25 e sintaxina-1A/1B. Per questo motivo, ho intrapreso uno studio per valutare il contributo individuale del taglio di SNAP-25 e di quello della sintaxina nell’attività della BoNT/C in vivo. Per fare questo mi sono basata su una recente pubblicazione in cui è stato riportato che due BoNT/C triple-mutanti, L200W/M221W/I226W (BoNT/C α-3W) e S51T/R52N/N53P (BoNT/C α-51), sono risultate selettive per la sintaxina. Grazie alla collaborazione col gruppo del Dr. T. Binz, ho ottenuto queste due BoNT/C mutanti, prodotte con metodi ricombinanti, e ne ho testato le loro proprietà biochimiche e tossicologiche. Quello che ho scoperto è che entrambe le triple-mutanti idrolizzano la sintaxina con un’efficienza simile alla tossina WT (BoNT/C-wt) ma, inaspettatamente, entrambe mantengono anche un'attività residua nei confronti della SNAP-25 (più elevata per la BoNT/C α-3W rispetto alla BoNT/C α-51). È interessante notare come questa attività sulla SNAP-25 sia strettamente correlata alla letalità delle tossine mutanti in vivo. D’altra parte, la proteolisi della sintaxina fornisce una sostanziale e prolungata compromissione neuromuscolare senza provocare il completo blocco della neurotrasmissione. Questi risultati suggeriscono che il taglio di SNAP-25 sia il principale determinante dell'attività neuroparalizzante e che derivati della BoNT/C, aventi attività selettiva per le sintaxina, potrebbero rappresentare una buona strategia per lo sviluppo di BoNTs dotate di attività prolungata e con un ampio margine di sicurezza.