Interaction between alpha-lactalbumin and lipids: conformational features and effects on protein aggregation

L’argomento di questa Tesi di Dottorato riguarda in generale aspetti del problema del folding e unfolding proteico, in linea con la tematica di ricerca condotta nel laboratorio di Chimica delle Proteine al CRIBI, dove le attività sono state per la maggior parte svolte. Il meccanismo di acquisizione della struttura tridimensionale di una proteina (folding) è un evento biologico importante. In generale, è un processo multi-stadio che coinvolge la formazione di intermedi, che sono stati parzialmente strutturati contenenti alcune caratteristiche strutturali della proteina nativa, ma non le interazioni finali tra le catene laterali che permettono alla proteina di esercitare la sua funzione specifica. Il fallimento nell’acquisizione del corretto folding (misfolding) può causare aggregazione proteica. Infatti, proteine parzialmente strutturate possono facilmente auto-assemblarsi in aggregati regolari insolubili (fibrille amiloidi), associati a gravi malattie, le cosiddette amiloidosi (Chiti & Dobson, 2006). In particolare, il mio progetto di Dottorato è focalizzato sull’?-lattalbumina (?-LA), una metallo-proteina del latte, ampiamente utilizzata come modello di studio del folding proteico. Nell’ultimo decennio, questa proteina ha suscitato un nuovo interesse per la scoperta di una variante che, oltre al ruolo fisiologico nella lattazione, è in grado di indurre apoptosi nelle cellule tumorali (Svensson et al., 1999). L’attività citotossica risiede nella formazione di un complesso con un acido grasso del latte, l’acido oleico (OA), denominato HAMLET (Human Alpha-lactalbumin Made LEthal to Tumor cells) (Svensson et al., 2000). Gli eventi cellulari causati da HAMLET sono stati estesamente studiati (Kohler et al., 2001; Duringer et al., 2003). Al contrario, il meccanismo e la natura dell’interazione tra ?-LA e OA e le proprietà fisico-chimiche del complesso non sono ancora completamente chiariti. Infatti, nonostante l’effettiva associazione dell’OA con la proteina in soluzione (Polverino de Laureto et al., 2002), si ritiene che il complesso così ottenuto possieda attività antitumorale minore dell’HAMLET, preparato secondo una procedura cromatografica (Svensson et al., 2000). Altre questioni dibattute riguardano la stechiometria proteina/acido grasso e lo stato monomerico/oligomerico dell’?-LA nel complesso. Inoltre, manca un’indagine sistematica dell’effetto della proteina sul comportamento di fase dell’OA. Lo scopo di questa Tesi di Dottorato è lo studio della capacità di legare OA ed esprimere attività citotossica di tre derivati proteolitici di ?-LA bovina, ottenuti per proteolisi limitata con pepsina a pH acido. L’uso di un approccio di proteolytic dissection di una proteina è stato largamente impiegato per studiare il folding di molte proteine (Wetlaufer, 1981; Gegg et al., 1997; Llinás & Marqusee, 1998). La caratterizzazione di frammenti proteici, contenenti elementi strutturali specifici della proteina intera (?-elica, ?-sheet) e in grado di assumere struttura in modo autonomo, è stata usata con successo per chiarire caratteristiche strutturali di ?-LA (Polverino de Laureto et al., 1999; 2001). Infatti, frammenti corrispondenti a domini strutturali in proteine multi-dominio hanno mostrato in alcuni casi la capacità di acquisire in soluzione una conformazione simile a quella nativa (Fontana et al., 2004). I frammenti di ?-LA studiati sono: la specie 1–40/53–123, priva di parte del dominio ? della?proteina nativa; 1–40/104–123, formato dal frammento N-terminale 1-40 legato covalentemente al frammento C-terminale 104-123 mediante due ponti disolfuro e contenente tre delle quattro ?-eliche di ?-LA; 53-103, contenente l’elica C e il sito di legame al calcio (Polverino de Laureto et al., 1999; 2001). Le differenze conformazionali dei tre frammenti sono state utilizzate come razionale per studiare la loro efficacia di legame all’OA, e per approfondire quindi il meccanismo di questo legame. Questo studio ha anche rilevanza fisiologica: la pepsina è un enzima dello stomaco e quindi queste specie potrebbero essere generate in vivo, nelle stesse condizioni di pH acido in cui si è ipotizzata la formazione del complesso HAMLET, contribuendo così all’attività apoptotica del complesso formato dalla proteina intera. I complessi dei tre frammenti con OA sono stati preparati prima seguendo la procedura cromatografica descritta per l’HAMLET, poi per diretto miscelamento in soluzione dei due componenti. Le proprietà conformazionali dei complessi sono state caratterizzate mediante dicroismo circolare, mostrando che i complessi preparati attraverso entrambe le procedure presentano conformazioni simili e acquisizione di ?-elica. Inoltre, è stato valutato l’effetto del calcio sulla conformazione dei complessi mediante dicroismo circolare. La spettroscopia di fluorescenza è stata utilizzata per analizzare il coinvolgimento dei residui di Trp nell’interazione con OA. Inoltre, è stata studiata la capacità dei complessi di indurre morte cellulare per apoptosi, in linea con l’attività citotossica mostrata dall’HAMLET. Per analizzare lo stato fisico dell’OA coinvolto nell’interazione con l’?-LA, il comportamento di aggregazione di OA è stato studiato con diverse tecniche, quali microscopia elettronica a trasmissione (TEM), titolazione con un colorante fluorescente e analisi turbidimetriche, ed è stato osservato un effetto di solubilizzazione dell’OA. Questi risultati hanno permesso di preparare un articolo che sarà presto spedito ad una rivista internazionale e che è allegato alla Tesi. Nella seconda parte del Dottorato, la ricerca è stata focalizzata sulla tendenza di ?-LA e dei suoi tre frammenti proteolitici ad aggregare. ?-LA è in grado di formare fibrille amiloidi in vitro, sebbene non sia associata a patologie. Fibrille di ?-LA si producono quando la struttura della proteina è parzialmente destabilizzata, ad esempio a pH acido, per riduzione di tre ponti disolfuro a pH neutro (Goers et al., 2002), o per taglio proteolitico (Polverino de Laureto et al., 2005). I lipidi possono agire come efficaci catalizzatori della fibrillogenesi, creando un ambiente in cui le molecole proteiche adottano una conformazione e un’orientazione che promuove il loro assemblaggio in strutture fibrillari (Thirumalai et al., 2003; Stefani, 2004; Sparr et al., 2004; Zhao et al., 2004). In particolare, poiché è noto che le interazioni proteina-acido grasso modulano il processo di fibrillogenesi (Kim & Takahashi 2006), i processi di aggregazione di ?-LA e dei suoi frammenti sono stati studiati per capire se e come l’OA possa influenzare la formazione di fibrille. In primo luogo, l’aggregazione è stata seguita a pH 2.0, in parallelo con il già noto comportamento fibrillogenico di ?-LA intera. In secondo luogo, l’aggregazione è stata studiata a pH 7.4, poiché in questa condizione fisiologica nella prima parte della Tesi sono stati studiati i cambiamenti conformazionali indotti dall’OA sulla struttura dei frammenti e la loro attività citotossica. La formazione di fibrille è stata seguita mediante saggi di fluorescenza con la tioflavina T (ThT), dicroismo circolare e TEM. Tutti e tre i frammenti sono in grado di produrre fibrille amiloidi a pH 2.0, analogamente all’?-LA. Ai valori di concentrazione proteica e rapporto proteina/lipide utilizzati, OA sembra accelerare la velocità di formazione di fibrille di ?-LA e dei frammenti a pH 2.0. A pH 7.4, ?-LA non forma fibrille amiloidi sia in assenza sia in presenza di OA. Anche i tre frammenti non sono stati in grado di formare fibrille a pH neutro, mentre in presenza di OA hanno mostrato un cambiamento conformazionale verso una struttura ?-sheet, hanno legato ThT e formato aggregati con la tipica morfologia amiloide. Durante il Dottorato, ho inoltre collaborato ad un progetto in corso nel laboratorio al CRIBI, relativo alla caratterizzazione di specie oligomeriche nel processo di aggregazione del lisozima umano, che appartiene alla cosiddetta “superfamiglia lisozima/lattalbumina”. Oligomeri solubili di lisozima sono stati prodotti a pH acido e alta temperatura, e quindi analizzati con varie tecniche, quali legame a molecole fluorescenti, spettroscopia infrarosso in trasformata di Fourier (FTIR) e proteolisi limitata. Gli oligomeri presentano superfici idrofobiche esposte al solvente, e gli spettri FTIR sono indicativi di specie altamente destrutturate. Inoltre, gli aggregati oligomerici di lisozima si sono rivelati più suscettibili alla proteolisi rispetto sia alla proteina monomerica sia alle fibrille mature, indicando la mancanza di una struttura organizzata. Questo studio ha dimostrato che gli oligomeri solubili di lisozima sono specie strutturalmente flessibili presenti a bassa concentrazione durante le fasi iniziali dell’aggregazione. I risultati di questo studio sono stati accettati per la pubblicazione in una rivista internazionale e il manoscritto in press è allegato alla Tesi. Durante il terzo anno di Dottorato, ho trascorso un periodo di sei mesi all’Università di Cambridge (UK), presso il Cambridge Centre for Proteomics, sotto la supervisione della Dr.ssa Kathryn Lilley. L’obiettivo di questo periodo è stato di apprendere metodologie di proteomica per l’identificazione di proteine su larga scala, ottimizzando le mie conoscenze di spettrometria di massa. Ho collaborato ad un progetto in corso nel laboratorio, incentrato su un metodo di purificazione di affinità in parallelo accoppiata a spettrometria di massa per identificare complessi proteici in embrioni di Drosophila melanogaster (Veraksa et al., 2005). Proteine con tre tags sono state generate (Spradling et al., 1999) e isolate da vari tessuti embrionali. La purificazione di affinità usando due tags in parallelo ha permesso di isolare complessi proteici nativi intatti. L’alta sensibilità e l’alta accuratezza di massa dello strumento ibrido LTQ-Orbitrap ha assicurato la massima copertura di componenti di complessi poco abbondanti, generando dati ad alta confidenza con basse false discovery rates. È stato utilizzato il software ProteinCenter™ (Proxeon) per la visualizzazione e l’analisi statistica dei set di dati. I risultati sono stati confrontati con dati presenti in database pubblici, confermandone la validità e aumentando l’autenticità delle interazioni individuate. Sono state inoltre mappate nuove interazioni proteiche non riportate in precedenza. Questi set di dati in vivo aggiungono alta confidenza al proteoma e ‘interattoma’ di D. melanogaster attualmente incompleto. In questa Tesi sono riportati in dettaglio i risultati di cinque proteine di diverse dimensioni e localizzazione cellulare, per presentare la procedura e l’efficienza della metodologia. In sintesi, questa Tesi di Dottorato è composta da una parte principale che riguarda la caratterizzazione dell’interazione tra ?-LA e acido oleico e gli effetti sull’aggregazione proteica, e una parte minore relativa all’analisi di spettrometria di massa di complessi proteici in Drosophila, oltre alla pubblicazione sulle specie oligomeriche studiate nel processo di aggregazione del lisozima.