Regulation of the Mitochondrial Permeability Transition Pore by Arginine Residue(s) and their Role in the Dimerization of F-ATP Synthase

La transizione di permeabilità mitocondriale (PT) è un aumento Ca2+-dipendente della permeabilità della membrana interna, mediato dal poro di transizione della permeabilità (PTP). A seconda della durata delle aperture e della dimensione del canale, il PTP può partecipare all'omeostasi del Ca2+ o alla morte cellulare. Negli anni '90, attraverso l'uso di modificatori di gruppi SH e di reagenti relativamente specifici di istidina e arginina, sono stati definiti alcuni siti regolatori del PTP. Prove recenti suggeriscono che PTP si forma dalla F-ATP sintasi. La prima parte del mio lavoro è stata dedicata all'identificazione dei residui di arginina che conferiscono la sensibilità del PTP ai gliossali, assumendo che il PTP si formi dalla F-ATP sintasi. Il fenilgliossale (PGO) è il reagente specifico per le arginine più comunemente usato. Ho osservato per la prima volta che il PGO influenza il PTP in modo specie-specifico (causando inibizione in topo e nel lievito, mentre induzione in drosofila e nell’uomo), indicando che, nonostante la sua capacità modulatoria sia diversa tra i vari organismi, la sua reattività è invece conservata. Ho potuto dimostrare che l’effetto del PGO è mediato in modo specifico dalla Arg 107 della subunità g della F-ATP sintasi, peraltro conservata tra le specie. I mitocondri di lievito privi di subunità g o esprimenti una subunità g con la mutazione R107A sono totalmente resistenti all'inibizione del PT da PGO. Questa scoperta è un passo avanti nella comprensione molecolare della regolazione PTP, e supporta ulteriormente l'ipotesi che il PTP si generi dalla F-ATP sintasi. La seconda parte del mio lavoro è stata dedicata a reinvestigare il ruolo del Ca2+ come fattore permissivo per l'apertura del PTP. L'ipotesi più recente sul meccanismo di formazione del PTP è che il legame del Ca2+ al sito di legame del metallo della subunità β (che contribuisce a coordinare il legame di Mg-ATP) causa un cambiamento conformazionale che viene propagato alle subunità inserite nella membrana interna attraverso il gambo laterale, portando all‘apertura del PTP. Eppure la PT si verifica ugualmente in assenza di Ca2+ aggiunto utilizzando diversi induttori compreso il p-idrossifenilgliossale (OH-PGO), uno dei reagenti di arginina che favorisce l'apertura del PTP nei mitocondri del fegato di ratto; e la fenilarsina ossido (PhAsO), un reagente dei ditioli e potente induttore del PTP. Tuttavia, nei miei studi ho osservato che l'apertura del PTP può sì verificarsi in presenza di EGTA dopo il trattamento dei mitocondri con OH-PGO e PhAsO, ma l'effetto di induzione temina con l'esaurimento del Ca2+ di matrice causato dallo ionoforo A23187 o con la chelazione del catione con BAPTA. Queste osservazioni indicano che in assenza del Ca2+ di matrice il PTP non può essere attivato da altri modulatori, confermando il ruolo permissivo e strettamente necessario del catione. Un'altra parte del mio lavoro è stata testare se amminoacidi carichi delle subunità di lievito e e g sono coinvolti nella loro reciproca interazione , svolgendo quindi un ruolo chiave nella dimerizzazione della F-ATP sintasi. Grazie ad una mutagenesi sito specifica, ho identificato la Arg 8 della subunità e come residuo critico per tale interazione, agendo molto probabilmente attraverso legami elettrostatici con la Glu 83 della subunità g. Abbiamo anche osservato che i dimeri purificati da BN gels da mutanti privi dell'Arg 8 mostrano una diminuzione della conduttanza e dell'attività di canale del PTP, indicando che questo residuo potrebbe partecipare direttamente alla generazione di un canale correttamente assemblato.