NANOASSEMBLATI DI AVIDINA E DNA COME STRUMENTI IN MEDICINA E DIAGNOSTICA

Questo lavoro origina dalla recente scoperta dell’esistenza in natura di una interazione ad alta affinità tra la proteina avidina e gli acidi nucleici e dal fatto che è possibile guidare tale interazione verso la formazione di nanoassemblati discreti e stabili. L’interesse verso questi sistemi deriva dal fatto che, in quanto costituiti da diverse unita’ di avidina unite assieme in modo stabile, essi possono potenzialmente trovare impiego in svariate applicazioni biotecnologiche e biomediche in analogia e come miglioramento del sistema avidina-biotina classico. Il lavoro descritto in questa tesi ha avuto un duplice obiettivo: approfondire le conoscenze relative alle basi molecolari dell’interazione tra avidina e DNA e al contempo valutare le effettive potenzialità in ambito applicativo dei nanoassemblati che originano grazie a tale interazione. Utilizzando diverse tecniche analitiche quali l’electrophoretic mobility assay, il quench della fluorescenza del triptofano, l’HPLC e il light scattering dinamico è stata studiata l’interazione tra avidina e acidi nucleici di diversa lunghezza (DNA plasmidico, DNA genomico, oligomeri sintetici) a singolo e doppio filamento. I risultati hanno fornito chiare indicazioni sulla dimensione del sito di binding, la modalità dell’interazione con le diverse tipologie di acidi nucleici e le relative costanti di dissociazione Kd. Lo studio dei meccanismi molecolari alla base dell’interazione tra la proteina e gli acidi nucleici ha permesso di ricavare informazioni preziose per l’ottenimento di formulazioni ottimizzate di nanoassemblati. Con lo scopo di verificare in termini pratici le potenzialità in ambito diagnostico dei nanoassemblati avidina-DNA è stata valutata la loro performance analitica in saggi di tipo ELISA e dot blot. I risultati ottenuti hanno dimostrato in modo inequivocabile la superiorità dei nanoassemblati rispetto all’avidina monomerica. In vista di un potenziale utilizzo in vivo dei nanaoassemblati come strumenti in diagnostica e nel direzionamento di farmaci è stata effettuata una prima indagine sulla loro biodistribuzione mediante imaging ottico di fluorescenza. I nanoassemblati sono in grado di circolare nel torrente sanguigno per oltre 72 ore e, a parte un lieve accumulo a livello epatico, non risulta evidente una distribuzione preferenziale verso determinati organi.