Discovering Sortases: From pilus biogenesis in Streptococcus pneumoniae to application in biotecnology

SOMMARIO I batteri Gram positivi espongono sulla loro parete cellulare proteine di superficie, molte di queste hanno una funzione relativa alla virulenza del batterio stesso, tra gli esempi del loro ruolo ci sono l’evasione dal sistema immunitario o l’iterazione con la superficie dell’ospite. Diverse proteine di superficie sono legate covalentemente allo strato di peptidoglicano dei Gram positivi attraverso un meccanismo di transpeptidazione, enzimi responsabili di quenza reazione sono stati denominati sortasi. Le sortasi sono in grado di riconoscere un motivo C-terminal LPxTG, effettuando un taglio tra i residui aminoacidici di Thr e di Gly, in maniera tale da avere in un primo step di reazione la formazione di un intermedio che viene poi risolto in un secondo momento da un attacco nucleofilo mediato dall’N-terminal del peptydil side chain del Lipid II precursore del peptidoglicano (Ton-That et al., 1999). Oltre all’ancoraggio di proteine di superficie le sortasi sono responsabili della polimerizzazione di nuovi fattori di virulenza recentemente identificati in batteri Gram positivi e noti come Pili. I Pili consistono in subunità covalentemente legate e assemblate grazie alle sortasi associate al pilo, le quali sono filogeneticamente e maccanicisticamente vicine alle housekeeping sortasi il cui ruolo è quello di ancorare le proteine alla parete cellulare (Telford et al., 2006). Diversi studi descrivono queste strutture come componenti elegibili per lo sviluppo di un vaccino, sebbene il meccanismo di assemblaggio risulta ancora rudimentale. Per meglio chiarire il ruolo delle sortasi associate al pilo in questo lavoro di tesi si è preso come modello lo studio delle sortasi in S. pneumoniae. In questo studio viene descritto infatti il ruolo delle sortasi nella biogenesi del pilo di S. pneumonaie, codificato da una regione nota come Pilus islet 1 (PI-1). Le sortasi relative a questa regione sono state caratterizzate usando diversi metodi biochimici, tra cui saggi di FRET ( Fluorescent Resonance Energy Transfer) e saggi di attività basati su analisi HPLC. Questi studi hanno permesso di fare analisi cinetiche e di studiare la specificità di substrato delle diverse sortasi relativa alle subunità che compongono il pilo, ossia RrgB, RrgA e RrgC. Analisi in vivo hanno poi permesso di confermare i dati ottenuti dallo studio in vitro. Dopo questa prima sessione, in questo lavoro si sono anche valutate le possibili applicazioni biotecnologiche capaci di sfruttare l’attività biologica delle sortasi. Recentemente svariate applicazioni biotecnologiche hanno permesso di sfruttare la transpeptidazione per di funzionalizzare proteine, processo noto col nome di Sortagging. Infatti le sortasi esercitano la loro attività anche in vitro in presenza di una proteina substrato ricombinante, contenente un motivo LPxTG e composti derivatizzati con oligoglicine che agendo da nucleofili risolvono la reazione di transpeptidazione in un prodotto finito modificato e funzionalizzato. Attraverso il Sortagging è possibile ottenere proteine fluorescenti, circolarizzarle o covalentemente unirle a supporto solido o banalmente è possibile ricreare un legame peptidico tra proteine con prodotti ricombinanti opportunamente modificati col motivo LPxTG e con oligoglicine (e.Gly3). Per le suddette applicazioni è stata ampliamente utilizzata l’housekeeping sortase A di S. aureus che è anche stata impiegata in questa tesi. Obiettivo è quello di creare un protein array per high troughput screening capace di rilevare iterazioni proteina-proteina. In questo contesto un protein array del Virus Influenza è stato sviluppato per lo screening di siero commerciale H1N1. Lisati batterici che esprimono proteine dell’Influenza virus modificate al C-terminal con il mofivo sortagging sono state immobilizate su glass-slide opportunamente derivatizzate con Gly3. Grazie alla specificità della sortasi A è possibile utilizzare estratti crudi evitandodi step di purificazione e un’immobilizzazione orientata. É stato applicato per la prima volta il processo di Sortagging per legare proteine di un genoma intero su supporto solido. L’idea è quella di poter applpicare la tecnologia a un ampio proteoma in grado di sviluppare un protein microarray ad alta densità.