The anti-apoptotic proteins DJ-1 and Mcl-1: molecular basis of different protein-ligand interactions leading to apoptosis.

DJ-1 e Mcl-1 sono due proteine anti-apoptotiche coinvolte in diverse gravi patologie come il morbo di Parkinson (PD) e il cancro. Pur appartenendo a famiglie di proteine differenti, entrambi i geni sono coinvolti nel processo apoptotico, inoltre, DJ-1 si trova a monte in un percorso che interessa la morte cellulare attraverso i membri della famiglia della proteina Mcl-1. La prima parte di questa tesi riguarda gli effetti della coniugazione subita da DJ-1 da parte di derivati chinonici della dopamina. Svariate funzioni sono state attribuite a DJ-1 e molti di queste sono collegati con PD, come ad esempio un ruolo protettivo contro lo stress ossidativo, sia come un sensore redox e come antiossidante. Lo stress ossidativo è considerato la principale causa di morte neuronale nel PD e, in particolare, la causa sembra coinvolgere lo stress ossidativo eccessivo generato da auto-ossidazione ed enzimatica della dopamina, che porta alla formazione di chinoni altamente reattivi (DAQ). La reattività del DAQ verso DJ-1 nelle cellule è riportata in letteratura, ma le basi molecolari e strutturali non sono ancora state studiate. I DAQ sono reattivi verso gli atomi nucleofili come l'atomo di zolfo tiolico tipico della cisteina. I tre residui di cisteina sembrano avere molto in ruoli diversi DJ-1: Cys106 è implicato l'attivazione di attività ossidativa e di chaperone. Le altre due cisteine, Cys53 e Cys46, si trovano nell’interfaccia dimerica. L'obiettivo principale della tesi è la comprensione delle modificazioni strutturali indotte dalla coniugazione di DA sui residui di cisteina mediante Dinamica Molecolare, NMR e dicroismo circolare (CD). La presenza di diverse quantità di proteina modificata da uno (150 Da) o due (300 Da) DAQ è stata confermata da SDS-PAGE, da analisi basate sulla radioattività 14C e dalla spettroscopia di massa. È interessante notare che lo stesso campione ha anche mostrato la presenza di una frazione dimerizzata covalente. Per chiarire quale cisteina e’ coinvolta nella dimerizzazione covalente, la stessa reazione è stata effettuata su due mutanti, C106A e C53A. formazione del dimero covalente non è stata rilevata nel mutante C53A. Per caratterizzare le modifiche strutturali, abbiamo acquisito molti 1H-15N heteronuclear single quantum coherence (HSQC) spettri sul WT, i campioni C53A e C106A prima e dopo trattamento con iDAQ. Numerose modifiche nello spettro causati dalla coniugazione con DAQ sono stati osservati. In particolare, un notevole numero di picchi mostra una diminuzione d’intensità, che indica una perturbazione dinamica indotta dalla coniugazione con i DAQ. Una simulazione di dinamica molecolare studio è stato utilizzata per esplorare le basi molecolari della modificazione covalente. Abbiamo osservato un profilo diverso residui fluttuazione causata dalla coniugazione in Cys106, in accordo con gli studi NMR. Abbiamo anche fornito una possibile spiegazione delle basi molecolari che porta alla dimerizzazione covalente. Per chiarire se la modifica covalente di dopamina possa portare ripercussioni sulla stabilità del DJ-1, abbiamo effettuato un test di stabilità termica controllata da CD, analizzando WT DJ-1 e la sua C53A e mutanti C106A, prima e dopo la reazione con DAQ. Per ogni coppia abbiamo trovato diversi profili, osservando una stabilità termica inferiore Cys106 quando è coinvolto. La seconda parte di questa tesi riguarda la proteina myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) e il suo ruolo nell’ apoptosi. Uno dei principali meccanismi anti-apoptotici comporta l'alterazione dell'espressione dei membri della famiglia Bcl-2, che è composta da 25 membri suddivisi in geni pro-e anti-apoptotici. L'equilibrio tra i livelli di proteine pro-ed anti-apoptotico è l'aspetto chiave, conducendo la cellula alla morte o alla sopravvivenza. Mcl-1 è un membro della classe anti-apoptotica, ed è una proteina altamente espressa in diverse linee cellulari tumorali. Anche se il meccanismo è ancora in discussione, Mcl-1 svolge il suo ruolo interagendo con BAK e BAX, membri pro-apoptotici della famiglia Bcl-2, e l'inibizione di questa interazione promuove la morte delle cellule in cellule tumorali. Per identificare nuovi piccoli peptidi in grado di impegnare la cavita-BH3 di Mcl-1 e per inibire l’interazione con i membri pro-apoptotici, abbiamo effettuato uno screening di 109 diversi peptidi 12-mer con la tecnica del phage display. NMR è stata utilizzata come tecnica di scelta per convalidare l’interazione, mentre la Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) e le analisi a fluorescenza polarizzata (FPA) sono stati utilizzati per misurare l'affinità. Tre peptidi con affinità nella gamma bassa micromolare sono stati identificati. La modalità di legame di questi peptidi è stata studiata in silico unitamente con le informazioni raccolte nel corso degli studi NMR. BLAST analisi delle sequenze individuate, identifica queste sequenze in una selezione di proteine interessanti tra cui glucochinasi, esochinasi, e una serie di soppressori tumorali. Una breve sequenza del peptide derivato da mostre glucochinasi dimostra un’affinità per Mcl paragonabile a quella osservata per un peptide endogeno di 12 residui. La sequenza si lega probabilmente con un orientamento contrario a quello tipico dell’elica BH3, ponendo in tal modo i residui conservati acido glutammico in luogo del residuo di acido aspartico conservate della sequenza BH3. Questi peptidi rappresentano la più corte sequenza mai osservata inibire Mcl-1, e possono giustificare lo sviluppo di composti di sintesi specifici e terapie a basati su peptidi. Inoltre, la loro identificazione può fornire la base per una maggiore comprensione delle possibili interazioni che si svolgono tra un numero di differenti proteine nella regolazione dell'apoptosi.