Pharmacology of natural polyphenols: prodrugs and biochemistry of Resveratrol and Pterostilbene

Questa tesi riguarda aspetti della farmacologia di due polifenoli: il Resveratrolo e lo Pterostilbene. Queste molecole di origine vegetale sono oggetto di intensa ricerca alla luce dei loro effetti biologici e biomedici, d’interesse per varie e distinte patologie legate all’età, infiammazione, cancro, obesità, neurodegenerazione e diabete. Tuttavia i meccanismi alla base dell’attività del Resveratrolo ed in particolare dello Pterostilbene non sono completamente noti. Inoltre, la presenza di gruppi idrossilici liberi (caratteristica tipica dei polifenoli) rende queste molecole un buon substrato per gli enzimi del metabolismo di fase II, la cui attività ne limita fortemente la biodisponibilità e lo sfruttamento farmacologico. Nel corso del mio dottorato mi sono occupato di entrambi questi temi. Descriverò prima il lavoro fatto per aumentare la biodisponibilità delle molecole precedentemente menzionate. In secondo luogo riassumerò le indagini sui meccanismi molecolari che sottendono l’attività dello Pterostilbene e del Resveratrolo. La strategia adottata dal mio gruppo per aumentare la biodisponibilità di questi polifenoli, considerati alla stregua di farmaci, si basa sull’uso di pro-farmaci. I pro-farmaci sono essenzialmente versioni protette di una determinata molecola. Il Resveratrolo in particolare presenta tre siti principali che dovrebbero essere protetti dagli enzimi del metabolismo di fase II, i gruppo idrossilici. Attraverso un processo di derivatizzazione chimica (svolto dal gruppo della prof.ssa Cristina Paradisi) i gruppi idrossilici sono stati protetti con dei gruppi sostituenti. La scelta della funzionalità chimica e dei sostituenti usati per la protezione è fondamentale per ottenere un pro-farmaco utile. Noi intendiamo i pro-farmaci come molecole terapeutiche adatte per la somministrazione orale. Questa via di somministrazione presume un’elevata stabilità negli ambienti gastrici ed intestinali, seguita da una moderata instabilità in altri ambiti fisiologici (sangue, tessuti, fluidi extracellulari) così da rigenerare il polifenolo naturale, attivo. Durante il mio progetto di dottorato abbiamo ottimizzato questi componenti dei pro-farmaci, il legame ed il gruppo sostituente, lavorando con il Resveratrolo, e poi abbiamo applicato i risultati ottenuti allo Pterostilbene. Ho iniziato lavorando su derivati acetalici del Resveratrolo. Abbiamo prodotto e testato una serie di composti “decorati” con brevi oligomeri di glicole etilenico legati agli ossigeni fenolici con dei legami di tipo acetalico. Tramite esperimenti ex vivo ed in vivo abbiamo identificato la molecola con quattro unità di glicole etilenico ed il legame acetale propriamente detto (Resv-O-CH(CH3)-OR) come pro-farmaco più promettente di questa serie di composti (capitolo 1: “Acetal derivatives as prodrugs of resveratrol”). La deprotezione completa per rigenerare Resveratrolo è risultata tuttavia piuttosto lenta. Abbiamo quindi deciso di testare nuovi derivati aventi un diverso legame chimico e diversi gruppi sostituenti. Il capitolo 2, “New water-soluble carbamate ester derivatives of resveratrol”, presenta i risultati ottenuti con derivati del Resveratrolo recanti PEG 350 o sostituenti di tipo zuccherino incorporati come carbammato N,N-di-sostituito. Queste molecole presentano il vantaggio di essere più idrosolubili, mantenendo al contempo la stessa capacità di permeazione delle membrane cellulari. Tuttavia, l’elevata stabilità di questi composti è risultata ancora problematica. La stabilità del legame carbammico può essere modulata variando il numero e caratteristiche dei sostituenti sull’atomo di azoto; abbiamo quindi testato il legame estere carbammato N-mono-sostituito, che ci attendevamo fosse più labile rispetto al suo equivalente di-sostituito. I capitoli 3 e 4 (rispettivamente “N-monosubstituted carbamate ester derivatives of resveratrol” and “Synthesis and evaluation of hydrophilic carbamate ester analogos of resveratrol”) presentano due serie di derivati del Resveratrolo contenenti aminoacidi, brevi oligomeri di glicole etilenico o sostituenti zuccherini collegati allo “scaffold” stilbenico con questo gruppo. La versione N-mono-sostituita del legame estere carbammato presenta un’elevata stabilità in ambiente acido, una buona stabilità a pH neutro e viene idrolizzata con un’opportuna cinetica in sangue di ratto. La stabilità di questi composti dipende in parte dal gruppo sostituente legato all’azoto. Tuttavia la maggior parte di essi ha dimostrato una reattività idonea all’uso come pro-farmaci del Resveratrolo (capitolo 3). Oltre a subire un rapido metabolismo di fase II, il Resveratrolo è anche poco solubile in acqua. La sua somministrazione è limitata a pillole o all’uso di eccipienti. Derivati del Resveratrolo solubili in acqua potrebbero quindi facilitarne la somministrazione, specialmente se cronica. Nel capitolo 4 presento derivati del Resveratrolo tri- di- e mono-derivatizzati come esteri carbammici N-monosostituiti; in queste molecole il gruppo sostituente è di tipo poliidrossilico (diidrossipropile o 6-deossigalattosio), e conferisce un’elevata solubilità in acqua. I derivati con il galattosio sono sostanzialmente confinati nell’intestino, dove si accumulano in particolare nei tratti finali, subendovi la progressiva perdita dei gruppi protettori. I derivati con il diidrossipropile vengono invece assorbiti dall’intestino. In particolare, i risultati migliori sono stati ottenuti somministrando i derivati mono-sostituiti. Ho quindi applicato le conoscenze acquisite lavorando con il Resveratrolo allo Pterostilbene, l’analogo 3,5-dimetilato del Resveratrolo. Poiché lo Pterostilbene è ancora poco caratterizzato abbiamo innanzitutto eseguito una dettagliata analisi sulla distribuzione della molecola negli organi dopo la sua somministrazione orale (capitolo 5, “Pharmacokinetics and tissue distribution of pterostilbene in the rat”). I livelli di Pterostilbene negli organi sono risultati molto elevati in paragone a quelli misurati nel sangue. Tuttavia, eccetto che nel cervello, il suo metabolita solfato è risultato la specie più abbondante nei tessuti esaminati. Abbiamo quindi testato una piccola libreria di pro-farmaci dello Pterostilbene basati sul legame carbammico N-monosostituito e amminoacidi naturali. Come ci attendavamo, la stabilità di questi derivati è compresa in un intervallo utile per l’uso come pro-farmaci. L’assorbimento dei derivati recanti amminoacidi apolari è fortemente incrementato (capitolo 6, “Boosting pterostilbene’s effects: a prodrug approach”). Oltre ad un intenso e sostenuto assorbimento intestinale, alcuni precursori si sono distinti per i livelli di Pterostilbene rigenerati nel sangue. Uno di questi composti è stato selezionato come più promettente e la sua distribuzione negli organi dopo somministrazione orale è stata mappata seguendo gli stessi criteri adottati per lo Pterostilbene (descritti nel capitolo 5). Il derivato stesso è stato la specie più abbondante misurata negli organi esaminati, eccetto che nel cervello, mentre i livelli del metabolita solfato erano diminuiti e quelli dello Pterostilbene aumentati nella maggior parte degli organi esaminati. I pro-farmaci possono quindi essere utili strumenti per aumentare la biodisponibilità di alcuni polifenoli. Nella seconda parte del mio dottorato ho condotto indagini, ancora in corso, su aspetti dei meccanismi cellulari con cui agiscono Resveratrolo e Pterostilbene. A tal scopo abbiamo adottato un duplice approccio, sia in vitro che in vivo, presentati in questa sede in due diversi capitoli, focalizzati in particolare sull’induzione di autofagia e sulla modulazione dei processi cognitivi deteriorati dall’età, rispettivamente. Infine, nel corso del mio dottorato sono stato coinvolto in altri progetti in corso nel gruppo. Questa partecipazione ha fatto sì che io fossi incluso fra gli autori di tre pubblicazioni, che includo in questa tesi come capitoli 9, 10 ed 11.