CARATTERIZZAZIONE DI DOMINI STAS DI PROTEINE DELLA FAMIGLIA SULP MEDIANTE TECNICHE DI RISONANZA MAGNETICA NUCLEARE

Le Permeasi del Solfato (SulP) rappresentano una famiglia di trasportatori di membrana che assorbono o scambiano anioni inorganici. Nei batteri e nelle piante, questi trasportatori mediano l’assorbimento del solfato, una fondamentale fonte di zolfo, essenziale per il metabolismo di Procarioti ed Eucarioti. È stato dimostrato che alcuni geni coinvolti nel metabolismo dello zolfo costituiscono dei fattori di virulenza in alcuni patogeni di mammifero. Nei Micobatteri, ad esempio, l’analisi dell’espressione genica in risposta a stress ambientali ha dimostrato un accumulo inducibile e stabile della proteina Rv1739c, un trasportatore ad alta affinità e specifico per il solfato appartenente alla famiglia SulP. Nei mammiferi, i trasportatori SulP sono rappresentati dalla famiglia SLC26 (Solute Linked Carrier). I trasportatori di mammifero sono degli scambiatori anionici molto versatili, essenziali per normale fisiologia e coinvolti nella fisiopatologia umana. La rilevanza clinica della famiglia Slc26 è stata evidenziata con l’identificazione di mutazione patogeniche in quattro geni coinvolti in patologie ereditarie (Slc26A2 - displasia diastrofica, Slc26A3 - diarrea congenita con perdita di cloruro, Slc26A4 - sindrome di Pendred, Slc26A5 - sordità non sindromica). Le proteine SulP sono costituite da una regione idrofobica N-terminale composta da un numero variabile di segmenti trans-membrana e da una porzione C-terminale citoplasmatica che include un dominio STAS (Sulphate Transporter and Anti-Sigma factor antagonist). Il dominio N-terminale è associato al trasporto anionico, mentre la funzione del dominio STAS rimane sconosciuta; ciononostante, nei trasportatori SulP vegetali e SLC26 di mammifero, lo STAS è considerato fondamentale per il corretto indirizzamento verso la membrana plasmatica e per la funzione di trasporto. L'analisi di sequenza ha dimostrato un’inattesa similarità tra la regione citoplasmatica C-terminale dei trasportatori SulP e le proteine batteriche ASA (AntiSigma-factor Antagonist), caratterizzate grazie alla determinazione strutturale di SPOIIAA (117 aa) di Bacillus subtilis. SpoIIAA presenta un foglietto β costituito da quattro filamenti, circondato da quattro α-eliche. A differenza degli ASA batterici, i domini STAS dei trasportatori anionici sono scarsamente caratterizzati per quanto riguarda sia la loro funzione, sia la loro struttura. Nei domini STAS, il foglietto β e il loop compreso tra il filamento β3 e l’elica α2 sono molto conservati, mentre, a livello del loop compreso tra l’elica α1 e il filamento β3 e in posizione C-terminale, sono previste delle estensioni variabili di differente lunghezza. Queste osservazioni indicano che, probabilmente, la struttura tridimensionale dei domini STAS dei trasportatori anionici devia in modo imprevedibile da quella degli ASA batterici. Pertanto, la caratterizzazione strutturale degli STAS della famiglia SulP è fondamentale per comprenderne la fisiologia e il ruolo che le mutazioni hanno nell’insorgere delle patologie. Attualmente non è disponibile alcuna struttura tridimensionale sperimentale né dei trasportatori SulP, né dei loro domini. La determinazione strutturale dei domini STAS è il principale scopo di questo progetto. In effetti, le dimensioni limitate di queste proteine le rendono studiabili mediante tecniche di NMR in soluzione. I domini STAS delle proteine presentate qui di seguito sono stati espressi in E. coli e studiati mediante NMR: 1) STAS di Rv1739c da Mycobacterium tuberculosis: abbiamo espresso un campione marcato con l’isotopo 15N, che ci ha consentito di raccogliere esperimenti HSQC di ottima qualità; la proteina tuttavia si è dimostrata estremamente sensibile alla temperatura e si è denaturata mentre venivano testate diverse condizioni. Il principale problema con questa proteina è comunque stata la bassa resa ottenuta dalla sua espressione. Sfortunatamente, poco prima di cambiare strategia di clonaggio (passando da una comune His-tag rimuovibile con trombina ad un dominio di fusione SUMO rimuovibile), l’assegnazione NMR della stessa proteina è stata pubblicata. 2) STAS di SULTR1;2 da Arabidopsis thaliana: abbiamo espresso un campione marcato con l’isotopo 15N, che ci ha consentito di raccogliere esperimenti HSQC che hanno dimostrato un livello di aggregazione compatibile con la formazione di omodimeri. La proteina si è dimostrata molto instabile ed è precipitata in modo massivo entro poche ore dall’inizio degli esperimenti. 3) STAS di Prestina da Rattus norvegicus. La Prestina (SLC26A5) è espressa in grandi quantità e in modo quasi esclusivo nelle cellule cigliate esterne OHC (Outer Hair Cell) dell’organo del Corti, nell’orecchio interno dei mammiferi; a differenza degli altri membri della famiglia SLC26, ha la proprietà unica di subire modificazioni conformazionali voltaggio-dipendenti, ed è considerata fondamentale nell’elettromotilità delle cellule OHC. In risposta a variazioni del voltaggio trans-membrana, agisce come un motore molecolare, subendo riarrangiamenti strutturali che ne alterano la sezione nella membrana plasmatica, modificando di conseguenza la lunghezza cellulare di anche il 5%. Mutazioni della Prestina sono state individuate come la causa di gravi deficit uditivi. Abbiamo prodotto un campione di STAS marcato con 15N e un campione doppiamente marcato con 15N e 13C; questo dominio si è dimostrato stabile alle concentrazioni millimolari (1.2 mM), nella forma di un monomero ben strutturato. Abbiamo raccolto i seguenti esperimenti NMR 13C,15N-eteronucleari: HNCO, HNCA, HN(CA)CO, CBCA(CO)NH, HNCACB, H(CA)NH, HBHA(CBCACO)NH, H(CCCO)NH, (H)CC(CO)NH, HCCH-TOCSY, CBHD, 13C-HSQC per gruppi aromatici, (H)C(NC)H-His, (HB)CB(CGCC)H-TOCSY (per Tyr e Phe), 13C-NOESY (per gruppi aromatici and alifatici), 15N-NOESY, oltre ad un C-detected HCACO. Tutti questi esperimenti hanno richiesto un tempo macchina di oltre 45 giorni. L’assegnazione della catena principale e delle catene laterali è completa per circa il 90% dei residui. Purtroppo questa proteina presenta alcuni problemi di scambio conformazionale che ne sopprimono i segnali dei gruppi HN in catena principale di due sequenze (35-55 and 73- 80). È stato tuttavia possibile fare alcune interessanti considerazioni di tipo strutturale.