COINVOLGIMENTO DEL RECETTORE-2 DI VEGF NELL'EFFETTO PRO-ANGIOGENICO INDOTTO IN CELLULE ENDOTELIALI UMANE DA AGONISTI DEL COMPLESSO RECETTORIALE CRLR/RAMP-2

Questo lavoro di tesi si è focalizzato sul coinvolgimento del recettore-2 del VEGF nell'effetto proangiogenico indotto in cellule endoteliali umane da agonisti del complesso recettoriale CRLR/RAMP-2. Punto di partenza è stata la dimostrazione, ottenuta con svariati esperimenti di angiogenesi in vitro (Matrigel assay e test di proliferazione) effettuati su cellule endoteliali umane di vena safena (HSVEC), che un ligando endogeno di tale recettore, quale Adrenomedullina (AM), ha un ruolo di stimolazione dell'angiogenesi in vitro. Il coinvolgimento del complesso CRLR/RAMP2 nel mediare tale effetto è stato verificato con esperimenti eseguiti su cellule in cui è stata inibita l'espressione di RAMP2 mediante RNA interference. Inoltre, l'azione pro-angiogenica del peptide osservata sulle HSVEC non è risultata secondaria ad un incremento della produzione di VEGF o dei suoi recettori. L'esame dell'effetto di adrenomedullina sull'espressione dell' mRNA per VEGF, VEGFR1 e VEGFR2 non ha infatti evidenziato nessun cambiamento di espressione dell' mRNA per questi marker e sia il silenziamento genico del VEGF che l'uso di un antagonista di VEGFR2 (V1), non sono stati in grado di inibire l'effetto pro-angiogenico di adrenomedullina. L'utilizzo, invece, di SU5416, un potente inibitore dell'attività  tirosin chinasica di VEGFR2 è stato in grado di inibire anche l'azione di AM. Da ciò è stato ipotizzato che il legame di adrenomedullina al complesso CRLR/RAMP2 possa indurre una transattivazione del recettore VEGFR2 del VEGF. Questa ipotesi è stata confermata e supportata da esperimenti di immunocitochimica, immunofluorescenza e western blotting mirati a valutare la fosforilazione di VEGFR2 dopo stimolazione delle HSVEC con AM. Di ulteriore conferma sono stati i dati ottenuti con intermedina, un altro peptide appartenente alla famiglia del calcitonin gene-related peptide (CGRP), che agisce anch'esso attraverso i recettori derivati dalla dimerizzazione di CRLR e RAMP. Anche il trattamento con tale peptide è stato infatti in grado di indurre nelle HSVEC la fosforilazione di VEGFR2 e di produrre un'azione pro-angiogenica in vitro. L'insieme di tali esperimenti ha portato alla conclusione che agonisti del complesso recettoriale CRLR/RAMP2 (quali adrenomedullina e intermedina) siano in grado di indurre un effetto pro-angiogenico in cellule endoteliali umane sfruttando l'attività  tirosin chinasica del VEGFR2 e come quindi ci possano essere modi alternativi di attivazione della cascata del segnale VEGF-dipendente anche in assenza di legame del fattore trofico al suo recettore.