STUDI SPERIMENTALI SUL MECCANISMO DELLA DISTROFIA DA MUTAZIONE A CARICO DEI GENI CODIFICANTI PER IL COLLAGENE VI

Le mutazioni dei geni che codificano per le subunità del collagene VI sono una delle cause delle patologie muscolari ereditarie umane che si manifestano come la Miopatia di Bethlem (BM), la Distrofia Muscolare Congenita di Ullrich (UCMD) e la Miosclerosi Congenita (CM). Basandosi sull’alto grado di eterogeneità e di parziale sovrapposizione tra di loro, è stato proposto che questi disordini possano rappresentare un “continuum” clinico piuttosto che entità strettamente separate, e che ci possa essere un più ampio spettro di disordini connessi al collagene VI. Nonostante i grandi progressi nella comprensione delle loro basi genetiche, la patogenesi molecolare rimane ancora in parte sconosciuta. Come nel caso di molti difetti genetici, la creazione di animali transgenici può essere la chiave per comprendere la fisiopatologia e per mettere a punto, e testare, potenziali terapie. Molti anni fa (Bonaldo et al, 1998) è stato creato un topo mutante con inattivazione mirata del gene COL6A1, che codifica per la catena 1(VI). In assenza della catena 1(VI), il collagene non è assemblato e non è secreto nella matrice extracellulare, e pertanto il topo omozigote mutante (Col6a1-/-) perde il collagene VI nei suoi tessuti. I topi sono affetti da un disordine miopatico ad esordio precoce con debolezza e cambiamenti istologici del muscolo scheletrico. I muscoli del Col6a1-/- perdono forza contrattile e mostrano alterazioni ultrastrutturali a livello del reticolo sarcoplasmatico (SR), dei mitocondri e apoptosi spontanea. E’ presente una disfunzione mitocondriale latente nelle miofibre che si può evidenziare con incubazione con oligomicina, inibitore della F1F0-ATPasi, che causa depolarizzazione mitocondriale, de-regolazione del Ca2+ e aumento dell’apoptosi. Questi difetti sono reversibili, e possono essere normalizzati piastrando le fibre muscolari di Col6a1-/- su collagene VI o somministrando cisclosporina A (CsA), un inibitore del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (PTP). Le miopatie dovute al collagene VI, sia umane che negli animali, possono essere efficacemente trattate con tale farmaco che agisce a valle della lesione patogenetica (Irwin et al, 2003 e Merlini et al, 2008). Così queste osservazioni portano ad ipotizzare che la mancanza del collagene VI causa un aumento dell’apertura del PTP ma non è ancora noto per mezzo di quale via di segnale. Un importante partner del collagene VI è il proteoglicano NG2. In particolare, ci sono prove che NG2 si leghi al collagene VI attraverso un interazione proteina-proteina (Tillet et al, 1997). NG2 può essere considerato un importante mediatore dell’interazione collagene VI-sarcolemma e il venir meno di questa relazione potrebbe avere un ruolo nella patogenesi delle distrofie di Bethlem e Ullrich. Sappiamo inoltre che modificazioni nella distribuzione superficiale di NG2 porta ad un parallelo cambiamento nella distribuzione del collagene VI (Nishiyama et al,1997). L’interazione NG2-collagene VI può essere importante nell’organizzazione della matrice, per il legame delle cellule alla matrice, per determinare la morfologia cellulare in risposta alla matrice, e per la trasduzione del segnale transmembrana. Per chiarire l’importanza di NG2 per la funzione e la struttura muscolare, sono stati studiati muscoli di topi con mutazione di NG2. Lo scopo dello studio è la caratterizzazione fenotipica comparativa (in vivo, ex vivo and in vitro) di Col6a1-/- and NG2-/- e la valutazione delle differenze tra i due modelli per comprendere se la mancanza di queste proteine porti ad un simile danno nella fibra muscolare. Si è proceduto dapprima a saggiare l’integrità della membrana con il colorante vitale blue Evans che permette di rilevare, evidenziandole con colorazione blu, le fibre muscolari il cui sarcolemma ha subito un danno. Poi, si è passati quindi all’analisi dei parametri funzionali della contrazione muscolare in vivo quali: - sviluppo di forza (Grip test) - sviluppo della forza massimale del gastrocnemio stimolato per via nervosa. Successivamente è stata effettuata una valutazione ex vivo: - meccanica dei muscoli interi diaframma, EDL e soleo - elettroforesi delle proteine muscolari - analisi istochimiche di gastrocnemio e tibiale. Infine per avere un quadro completo si è continuata l’ indagine in vitro : - transienti di calcio su singole fibre di FDB - elettroforesi su singole fibre di FDB - analisi immunocitochimiche. I risultati di tali analisi hanno mostrato che i due fenotipi hanno solamente una parziale sovrapposizione e quindi NG2 non rappresenta l’unica via di mediazione della presenza del collagene VI. Il ruolo delle integrine richiede di essere esplorato.