Neuronal hydrogen peroxide promotes nerve terminals regeneration at neuromuscular junction

La giunzione neuromuscolare (GNM) costituisce il sito di trasmissione di un impulso elettrico dal terminale del motoneurone alla fibra muscolare; l’organizzazione strutturale di questo sistema altamente dinamico è stata ulteriormente complicata dall’aggiunta delle cellule di Schwann perisinaptiche (CSPs), dando origine al concetto di sistema tripartito. Le CSPs sono cellule di Schwann non mielinizzanti strettamente adese alla zona di contatto tra nervo e muscolo; esse partecipano attivamente a molte funzioni fisiologiche della GNM, come il suo sviluppo embrionale ma anche il corretto mantenimento di GNMs adulte. Esse sono inoltre in grado di percepire e modulare l’attività sinaptica, mediante l’attivazione di recettori muscarinici e purinergici presenti sulla loro superficie. Studi più recenti hanno dimostrato che le CSPs sono coinvolte nei processi di recupero che hanno luogo in risposta ad un danno nervoso; in seguito a denervazione o a ridotta attività sinaptica, le CSPs de-differenziano, diventando CSPs “reattive”, ed iniziano a proliferare. Queste CSPs reattive partecipano attivamente ai processi di degenerazione e rigenerazione nervosa: esse subiscono variazioni nella loro espressione genica e acquisiscono attività simil-macrofagiche, contribuendo alla rimozione dei detriti neuronali e reclutando fagociti in seguito al rilascio di citochine e chemochine. Inoltre, in seguito alla degenerazione dei terminali nervosi, le CSPs presenti alle placche motrici denervate estendono lunghi processi citosolici in grado di indurre e guidare la ricrescita neuronale. Considerando la crescente incidenza di malattie neurodegenerative che inizialmente interessano in maniera selettiva i terminali dei motoneuroni – quali la SLA e le neuropatie autoimmuni -, sarebbe senz’altro utile caratterizzare in maniera più approfondita il crosstalk tra terminali nervosi in degenerazione e le adiacenti CSPs. In particolare, l’identificazione di mediatori molecolari coinvolti nell’attivazione delle CSPs e nel processo di rigenerazione nervosa potrebbe rivelarsi cruciale per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. A tale scopo, abbiamo adottato un approccio sperimentale innovativo, alternativo al cut/crush del nervo sciatico tradizionalmente utilizzato fino ad oggi. Al fine di effettuare un danno localizzato ai soli terminali nervosi, evitando il coinvolgimento di molti tipi cellulari e mediatori dell’infiammazione come accade nel corso della degenerazione Walleriana, abbiamo deciso di sfruttare il meccanismo d’azione di due classi di neurotossine presinaptiche animali: α-Latrotoxin, una tossina formante poro presente nel veleno dei ragni del genere Latrodectus, ed alcune neurotossine di serpente dotate di attività fosfolipasica, denominate SPANs. Entrambi i tipi di neurotossine inducono un’acuta e altamente riproducibile degenerazione dei terminali nervosi dei motoneuroni, seguita entro pochi giorni da una rigenerazione completa: l’azione di tali neurotossine rappresenta quindi un sistema appropriato e controllato per esaminare i meccanismi molecolari alla base della degenerazione e rigenerazione nervosa, come anche il contributo delle CSPs a tali processi. Abbiamo precedentemente dimostrato che i terminali nervosi esposti ad α-Ltx e SPANs deegenerano a causa di un eccessivo influsso di calcio nel citosol, che a sua volta induce un danno mitocondriale. In questo lavoro, abbiamo dimostrato che neuroni primari intossicati aumentano la produzione di H2O2 a livello mitocondriale: il perossido di idrogeno è una molecola stabile e diffusibile attraverso membrane lipidiche, e potrebbe perciò agire come segnale paracrino su cellule adiacenti. Infatti, l’esposizione di cellule di Schwann (CSs) primarie in coltura a basse concentrazioni di H2O2 induce la fosforilazione di ERK, con la conseguente attivazione di pathways a valle. È stato recentemente dimostrato che la via di ERK gioca un ruolo fondamentale nel controllo della plasticità delle CSs durante la rigenerazione nervosa in vivo, ma fino ad oggi i mediatori molecolari responsabili per l’attivazione di tale pathway non sono ancora stati identificati: il perossido di idrogeno prodotto dai neuroni in degenerazione costituisce un buon candidato per tale ruolo. In supporto a tale ipotesi, abbiamo osservato che il livello di fosforilazione di ERK è ridotto in co-colture di neuroni e CSs intossicate e pre-incubate con catalasi, che converte rapidamente il perossido di idrogeno in ossigeno ed acqua: ciò conferma che il perossido di idrogeno prodotto dai neuroni diffonde effettivamente nel mezzo extracellulare fino a raggiungere le vicine CSs, nelle quali induce l’attivazione della via di ERK. Tale attivazione è riscontrata anche nelle CSPs alle GNMs intossicate in vivo. Per confermare il coinvolgimento del perossido di idrogeno nell’induzione della rigenerazione nervosa, abbiamo effettuato registrazioni elettrofisiologiche ed esperimenti di immunoistochimica, ed entrambi gli approcci sperimentali hanno dimostrato che in la somministrazione di catalasi in vivo ritarda il processo di rigenerazione nervosa in muscoli intossicati. Inoltre, il pre-trattamento con un inibitore della via di ERK - PD98059 – rallenta la il recupero dall’intossicazione con una cinetica molto simile a quella osservata in presenza di catalasi, supportando l’idea che in effetti il perossido di idrogeno promuova la rigenerazione nervosa attraverso l’attivazione della via di ERK nelle CSPs