Functional characterization of potassium channels in the cyanobacterium synechocystis SP.PCC 6803

Prima del Pre-Paleozoico, l'atmosfera terrestre aveva una composizione diversa rispetto a quella quella di oggi, infatti, gli organismi non erano in grado di vivere in condizioni aerobiche. L'avvento dei cianobatteri ha portato rilevanti innovazioni, infatti, questi a differenza di altri batteri fototrofi esistenti a quel tempo, presentavano molecole di clorofilla e complessi proteici che permisero di utilizzare l’acqua come donatore di elettroni per la produzione dell’ossigeno. Questa modificazione ha permesso, lungo milioni di anni, di ottenere l'attuale atmosfera. Tutti questi cambiamenti portarono ad una inevitabile evoluzione biochimica e metabolica degli organismi. Nel Proterozoico o agli inizi del Cambriano, i cianobatteri iniziarono a risiedere all'interno di alcune cellule eucariotiche. Secondo la teoria endosimbiotica, i cloroplasti evolsero da un piccolo cianobatterio primitivo presente all'interno delle cellule eucariotiche. Oggi, i cianobatteri si trovano in diversi ambienti terrestri, da oceani ad acque dolce, in terre artiche, in deserti ed in sorgenti termali. La nostra attenzione è focalizzata sul cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803. Questo ceppo è stato isolato per la prima volta da una sorgente di acqua dolce in California e ora è considerato un buon organismo modello per studi scientifici. È spontaneamente trasformabile, è in grado di integrare DNA estraneo nel suo genoma attraverso ricombinazione omologa (consentendo la sostituzione mirata dei geni) e può crescere in assenza di fotosintesi se viene fornita un'adeguata fonte di carbonio, come il glucosio. Inoltre è il primo organismo fotosintetico per il quale il genoma è stato sequenziato (Kaneko et al., 1996). Nel proteoma di Synechocystis sono stati identificati diversi putativi canali ionici (Kuo et al., 2005). Tuttavia, nessuno di essi è stato caratterizzato da un punto di vista funzionale e il loro ruolo fisiologico rimane ancora sconosciuto. I canali ionici sono proteine di membrana che controllano il passaggio degli ioni attraverso esse. Queste proteine, in tutti i procarioti e gli eucarioti, permettono la corretta distribuzione ionica necessaria per le funzioni cellulari. Le caratteristiche base dei canali sono la selettività ed il gating, la prima è la proprietà che controlla il tipo di ioni che attraversa la membrana, la seconda è il processo di apertura e chiusura del percorso degli ioni. In realtà il passaggio attraverso il poro è regolato da un gate, che può essere aperto o chiuso da segnali chimici, meccanici o elettrici (Hille, 2001). Il potassio (K+) è il catione più abbondante negli organismi viventi e svolge un ruolo cruciale per la sopravvivenza e lo sviluppo delle cellule, regolando l'attività enzimatica e il potenziale di membrana. Questo è uno dei motivi per i quali i canali del potassio sono una delle classi di canali più studiate. Il campo dei canali del potassio procariotici ha subito un rapido sviluppo negli ultimi anni grazie all'applicazione di una combinazione di tecniche di bioinformatica e biologia molecolare, affiancate a studi di elettrofisiologia e studi strutturali. La comprensione della loro struttura e del meccanismo di conduzione degli ioni permette di ottenere ulteriori informazioni sulla funzione dei canali di potassio in generale. Uno screening bioinformatico del proteoma di Synechocystis sp. PCC 6803 ha individuato due proteine putative su cui abbiamo concentrato la nostra attenzione. La prima è stata chiamata SynK e mostra omologia di sequenza con KvAP (un canale del potassio voltaggio di A. pernix) (Jiang et al., 2003). La seconda, SynCaK, mostra omologia di sequenza con MthK, un canale del potassio Ca2 +-dipendente di M. thermoautotrophicum (Jiang et al., 2002). Il nostro obiettivo era quello di capire se effettivamente queste proteine funzionano come canali ionici e di comprendere il loro ruolo nella fisiologia dei cianobatteri. Le caratteristiche e la funzione di queste proteine sono state studiate attraverso un approccio integrato comprendente tecniche di biologia molecolare, biochimica, elettrofisiologia e microscopia. Il gene SynK è stato inizialmente identificato nel genoma di Synechocystis sp. PCC 6803 utilizzando la sequenza amminoacidica del filtro di selettività (TMTTVGYGD) come sequenza query. Questa proteina di funzione sconosciuta mostra sei segmenti transmembrana (S1-S6) ed una regione del poro tra le eliche S5 e S6. Prima di iniziare il mio Dottorato, SynK è stato clonato ed espresso in cellule di mammifero (Chinese Hamster ovary, CHO) in fusione con la EGFP (una proteina fluorescente). Una successiva analisi western-blotting ha dimostrato che la proteina di fusione è correttamente espressa. Studi di microscopia confocale hanno dimostrato la sua localizzazione nella membrana di cellule CHO e l'analisi patch-clamp ha rivelato un'attività di canale outwardly rectifying selettivo per il potassio. Inoltre, è stata dimostrata per SynK, in frazioni di membrana isolate da cianobatteri, mediante microscopia elettronica (attraverso la tecnica dell’immunogold) e tecniche di western blot, una doppia localizzazione nella plasmamembrana e nelle membrane tilacoidi.Durante il mio Dottorato, è stata eseguita la costruzione di due diversi mutanti del canale SynK. Il primo mutante corrisponde alla proteina con una mutazione puntiforme nel filtro di selettività del poro (mutazione Y181A) e utilizzato per l'espressione in cellule CHO. In base alla letteratura, questa proteina mutante perde la sua attività di canale del potassio. Inoltre, è stato prodotto un ceppo mutante knock-out (ΔSynK) in Synechocystis. La sua analisi funzionale ha permesso di capire il ruolo fisiologico di SynK nei cianobatteri. Al fine di caratterizzare la funzione della proteina SynK, abbiamo inizialmente verificato, attraverso western blot, che il ceppo mutante effettivamente non esprimesse la proteina. Mentre per valutare il ruolo fisiologico della proteina SynK, abbiamo confrontato la crescita del ceppo wild-type (WT) e mutante in diverse condizioni. La caratterizzazione del fenotipo mutante è stata studiata confrontando l’attività fotosintetica nel WT e nel mutante. Utilizzando un approccio simile abbiamo identificato nel genoma di Synechocystis sp. PCC 6803 una seconda proteina classificata come putativo canale del potassio che mostra omologia di sequenza con MthK, un canale del potassio calcio dipendente di Methanobacterium thermoautophicum. Attraverso l’utilizzo di vari programmi di predizione strutturale, abbiamo analizzato la sequenza primaria della proteina tradotta e abbiamo osservato che questa (che abbiamo chiamato SynCaK), come MthK, contiene due segmenti transmembrana, un filtro di selettività tipico dei canali del K+, con sostituzioni conservative, e un dominio di regolazione della conduttanza del potassio (RCK domain). Anche in questo caso, abbiamo clonato ed espresso la proteina in fusione con EGFP in cellule CHO e studiato la loro attività tramite patch clamp. Inoltre, al fine di studiare il ruolo di SynCaK nella fisiologia dei cianobatteri abbiamo prodotto un mutante knock-out per SynCaK. Per ottenere ulteriori informazioni sull’attività del canale, abbiamo espresso e iniziato la purificazione della proteina in un altro sistema eterologo, E. coli. Le proteine canale-ricombinanti sono spesso studiate mediante la loro integrazione in doppi strati artificiali (Ruta et al., 2003). Durante il mio Dottorato, ho anche continuato il lavoro iniziato durante la mia tesi di laurea in Biotecnologie Industriali sullo studio dei canali ionici nei mitocondri delle Graminaceae. Tecniche classiche di bioenergetica hanno rivelato attività compatibili con la presenza di un canale di potassio nei mitocondri di grano duro, ma lo studio dei canali nei mitocondri di sistemi vegetali è un campo ancora inesplorato nel mondo. A tal fine, è stato iniziato uno studio attraverso l'utilizzo parallelo di diverse tecniche, che hanno consentito una caratterizzazione più completa delle attività dei canali presenti nei mitocondri di grano. In particolare, sono stati seguiti due approcci. In primo luogo, studi biochimici sui mitocondri isolati, attraverso l'uso di SDS-PAGE e immunoblotting, che hanno permesso la valutazione del campione utilizzato in termini di arricchimento e di purezza (dati del tutto assenti in letteratura fino ad oggi). In secondo luogo, sono state definite preparazioni di mitocondri da radici di grano duro adatte per studi elettrofisiologici. In particolare, per la prima volta è stata applicata la tecnica di patch clamp su mitocondri vegetali. Infine, ho svolto una collaborazione con il laboratorio del Professor Nobuyuki Uozumi presso la Tohoku University in Giappone. Questo gruppo ha ottenuto un mutante per l’acquaporina di Synechocystis. Le acquaporine sono proteine di membrana incorporate nelle membrane cellulari che regolano il flusso dell'acqua. Ho contribuito alla caratterizzazione del mutant-less acquaporin attraverso esperimenti di misura dell'attività fotosintetica. In particolare, sono stati eseguiti diversi esperimenti di evoluzione di ossigeno che dimostrano che l'efficienza fotosintetica è più alta nel mutante rispetto al WT quando gli organismi vengono incubati in un mezzo iperosmotico. Il passo successivo sarà quello di chiarire esattamente come uno stress iperosmotico e l'assenza di acquaporina sono correlati con la fotosintesi e quindi il meccanismo sottostante.