PRESENILINS AND Ca2+ HOMEOSTASIS: ROLE IN ALZHEIMER'S DISEASE AND CELL PHYSIOLOGY

La malattia di Alzheimer (Alzheimer's Disease, AD) è una patologia neurodegenerativa progressia e rappresenta la forma più comune di demenza senile. Le caratteristiche istopatologiche dell'AD sono le fibrille intraneuronali e le placche amiloidi, formate da aggregati di peptidi amiloidi (Aβ), che si depositano nella matrice extracellulare del cervello. I peptidi Aβ sono il prodotto di due tagli sequenziali della proteina precursore dell'amiloide (amyloid precursor protein, APP). L'ultimo taglio proteolitico di APP, che porta al rilascio degli Aβ nella matrice extracellulare, è opera dell'enzima γ-secretasi. Le forme più abbondanti di peptidi Aβ, entrambe fisiologicamente prodotte nel corso della vita, sono Aβ40 e Aβ42, che è più insolubile e incline ad aggregare. Sebbene la maggioranza dei casi di AD sia di origine sporadica, una piccola percentuale di pazienti è affetta dalla forma ereditaria di AD (Familial Alzheimer's Disease, FAD), causata da mutazioni dominanti in uno dei tre geni che codificano per l'APP, per la presenilina-1 (PS1) e la presenilina-2 PS2). Le preseniline (PSs) sono le subunità  catalitiche del complesso enzimatico dellaγ-secretasi. Mutazioni associate a FAD nelle PSs portano ad un aumento del rapporto Aβ40/Aβ42, che favorisce il depositarsi delle placche amiloidi. Oltre a questo effetto sulla produzione di Ab, è stato ampiamente dimostrato che molte mutazioni nelle PS1 e PS2 causano alterazioni nell'omeostasi intracellulare del Ca2+, rendendo così i neuroni più sensibili a stimoli eccitotossici e all'apoptosi. Ciò nonostante, gli effetti e i meccanismi di questa interferenza nel normale equilibrio intracellulare del Ca2+ sono ancora poco chiari e oggetto di intensa indagine. A lungo, l'ipotesi più popolare è stata l'ipotesi del "sovraccarico di Ca2+", la quale afferma che le PSs mutate danno origine a esagerate risposte Ca2+ in seguito a stimolazione, sostenute da depositi intracellulari (in particolare, il reticolo endoplasmatico, ER) sovraccarichi di Ca2+. Tuttavia, un crescente numero di studi ha di recente iniziato a mettere in discussione questa ipotesi e diversi possibili bersagli dell'azione delle PSs sono stati proposti. Studi precedenti condotti nel nostro laboratorio hanno mostrato che un certo numero di PS1 e PS2 mutate associate a FAD riducono il contenuto di Ca2+ dell'ER; partendo da queste osservazioni, abbiamo indagato il/i meccanismo/i alla base di questo effetto. La pompa SERCA-2 è stata identificata come il bersaglio più probabile dell'azione della mutazione associata a FAD T122R nella PS2 (PS2-T122R) e infatti le due proteine, SERCA-2 e PS2-T122R, interagiscono, come dimostrato da esperimenti di co-immunoprecipitazione. E' stato dimostrato che la PS2-T122R danneggia l'attività della pompa riducendo la sua velocità  massima di trasporto, mentre il livello della proteina rimane inalterato. E' interessante notare, inoltre, che risultati simili sono stati ottenuti con la PS2 non mutata (wild-type, wt): l'espressione transiente della PS2 wt in un modello cellulare privo di PSs ha avuto come conseguenze un abbassamento della concentrazione di Ca2+ nell'ER all'equilibrio e un rallentamento della velocità di importo del Ca2+ nell'ER. Coerentemente con questa osservazione, l'abbattimento dell'espressione della PS2 endogena mediante la tecnica di RNA interference ha portato ad un incremento di entrambi questi parametri. Questi risultati suggeriscono un ruolo fisiologico della PS2 nella regolazione intracellulare del Ca2+; la PS2 agirebbe come un freno per le pompe SERCA. Infine, la sovra-espressione della SERCA-2B assieme alla PS2-T122R ha permesso di riportare i valori del contenuto di Ca2+ nell'ER e della velocità della pompa ai valori di controllo. Uno degli obiettivi a lungo termine di questo progetto è studiare le dinamiche intracellulari del Ca2+, sia in vivo che in vitro, nel cervello di topi transgenici usati come modello di AD, in quanto basati su mutazioni nell'APP e in PS associate a FAD. L'approccio scelto è monitorare le variazioni di Ca2+ in singola cellula attraverso sonde per il Ca2+ basate su FRET, i cameleons. Pertanto, la seconda parte di questo lavoro è stata dedicata alla messa a punto preliminare delle condizioni sperimentali più adatte da adottare con due sonde cameleons, geneticamente indirizzate nel lume dell'ER e dell'apparato di Golgi. Mentre i risultati ottenuti con il cameleon indirizzato all'ER corrispondono a quelli ottenuti in precedenza con un'equorina indirizzata all'ER, un risultato inaspettato è emerso utilizzando un nuovo cameleon localizzato in uno specifico compartimento del Golgi. Questa nuova sonda ci ha aiutato a definire meglio il meccanismo di azione della PS2-T122R, mostrando che agisce selettivamente sulle pompe SERCA-2 ma non sulle pompe SPCA1.