Relationships between mitochondrial [Ca2+] and ROS in experimental model of cardiac disease

Variazioni dell’omeostasi del [Ca2+] ([Ca2+]I) intracellulare, disfunzione mitocondriale e specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono generalmente interconnessi. Di conseguenza, è difficile stabilire una sequenza di eventi e relazioni di causa ed effetto. Per esempio, un aumento di [Ca2+]I influenza il [Ca2+] mitocondriale e, in molti casi, è associato con un aumento di ROS mitocondriali che portano all’apertura del poro di transizione mitocondriale (PTP), disfunzione mitocondriale e morte cellulare. D’altro canto, i ROS modificano l’omeostasi del [Ca2+]I interagendo con vari siti coinvolti nei flussi di Ca2+ intracellulari. I cambiamenti indotti dal [Ca2+]I sulla formazione dei ROS e viceversa sono molto rapidi, rendendo difficile definire l’evento primario sia in seguito sia ad un evento fisiologico che ad un evento patologico. I ROS sono prodotti in vari siti intracellulari e nei cardiomiociti i mitocondri sono il compartimento a più alto potenziale ossidoriduttivo. I mitocondri sono molto sensibili all’ossidazione, rappresentando sia una fonte che un bersaglio dei ROS. Tuttavia gli enzimi responsabili per la formazione dei ROS mitocondriali in condizioni patofisiologiche sono ancora motivo di discussione. Un’ulteriore complicazione è legata alle tecniche disponibili. Mentre esistono vari metodi per indurre un aumento primario e diretto di [Ca2+]I, i protocolli esistenti per innescare una produzione di ROS sono tutt’altro che specifici. Un aumento di ROS è in genere ottenuto come conseguenza della somministrazione di un ossidante esogeno (soprattutto H2O2) o applicando stimoli patologici (i.e. inibizione della catena respiratoria) che innescano inevitabilmente diversi altri effetti, incluse alterazioni nell’omeostasi del [Ca2+]I. In questo lavoro ci poniamo come obiettivo la risoluzione di questi problemi valutando gli effetti di un aumento primario dose-dipendente dei livelli di ROS mitocondriali sulla fisiologia cellulare, specialmente in cardiomiociti neonatali di ratto (NRVMs). Per indurre un aumento primario dei livelli di ROS mitocondriali, abbiamo trattato i NRVMs con un analogo del paraquat diretto ai mitocondri (Mitochondrial Paraquat, MitoPQ). Questo composto si accumula selettivamente nella matrice mitocondriale e provoca la formazione di ROS per mezzo di un meccanismo ossidoriduttivo che coinvolge il complesso flavinico del complesso I della catena di trasporto degli elettroni (ETC). Inizialmente, abbiamo stabilito una curva dose-risposta con dosi diverse di MitoPQ valutando la formazione di ROS, la funzione mitocondriale e la funzione della cellula. Abbiamo osservato che cellule trattate con alte dosi di MitoPQ mostravano un aumento dose-dipendente dei livelli di ROS mitocondriali. Alti dosaggi hanno portato ad una diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm), apertura del PTP, omeostasi citosolica del [Ca2+] compromessa e morte cellulare. Successivamente, ci siamo chiesti se alte dosi di MitoPQ potessero innescare vie di segnalazione mitocondriali coinvolte nella formazione dei ROS. Ci siamo focalizzati sull’attività delle monoammino ossidasi (MAOs) che sono state recentemente identificate come contribuenti dello stress ossidativo nelle patologie cardiache. L’inibizione della MAO ha prevenuto la formazione di ROS indotta dal MitoPQ, così come la disfunzione mitocondriale e la morte cellulare. Oltre a questa via di amplificazione, questi risultati forniscono la prova diretta che i ROS prodotti nei mitocondri possono influenzare i processi citosolici, specialmente l’omeostasi del [Ca2+]I. L’interazione tra Ca2+, ROS e funzione mitocondriale ha un ruolo essenziale nella cardiomiopatia diabetica (DCM). Pertanto abbiamo esteso i risultati ottenuti con il MitoPQ, specialmente l’amplificazione indotta dalla MAO e l’alterazione dell’omeostasi del [Ca2+]I indotta dai ROS mitocondriali, a un modello cellulare di DCM. NRVMs trattati con alti livelli di glucosio (HG) e interleuchina-1β (IL-1β) hanno manifestato un aumento significativo di livelli di H2O2 mitocondriale, sia dopo un trattamento prolungato (48 h) che breve (1 h). L’inibitore della MAO pargilina ha prevenuto questo aumento dei livelli di ROS. Quindi, abbiamo testato l’effetto dell’inibizione della MAO sull’omeostasi del [Ca2+] citosolico in cellule trattate con il protocollo diabetico. Sorprendentemente, HG e IL-1β non hanno modificato significativamente i parametri oscillatori del Ca2+ (i.e. ampiezza, frequenza, area sotto la curva), mentre il pretrattamento con la pargilina o con la N-(2-Mercaptopropionil)glicina (MPG) ha peggiorato il difetto di contrattilità indotto da HG e IL-1β, compromettendo le oscillazioni. Questo risultato inaspettato suggerisce che un tono ossidativo di base sia necessario per un appropriato riciclo del Ca2+ in cardiomiociti trattati con HG e IL-1β. Bisogna sottolineare che il diabete è correlato alla disfunzione delle β cellule pancreatiche. Nelle β cellule pancreatiche è stato dimostrato che lievi scariche di ROS contribuiscono all’omeostasi del [Ca2+]I e la secrezione di insulina dipendente dal Ca2+. Nonostante nel diabete un marcato stress ossidativo conduca alla disfunzione delle β cellule, un aumento primario e moderato di ROS potrebbero modulare i transienti di Ca2+ promuovendo la secrezione di insulina. Abbiamo testato quest’ipotesi sulle β cellule Min6, una linea cellulare di insulinoma che può essere usata come modello di diabete applicato alle β cellule pancreatiche. Abbiamo innescato un aumento di livello di ROS intracellulari trattando le Min6 con alluminio ftalocianina cloruro (AlClPc), un fotosensitizzatore comunemente usato in terapia fotodinamica. La fotoattivazione dell’AlClPc induce cambiamenti chimici nelle molecole circostanti inducendo la produzione di ROS in quantità dipendente dall’intensità dell’illuminazione del LED. I risultati ottenuti hanno evidenziato che la modulazione dei ROS indotta dalla fotoattivazione dell’AlClPc o l’inibizione della pompa Calcio/ATPasi del reticolo endoplasmico (SERCA) per mezzo della tapsigargina (Tg) hanno indotto una simile accelerazione delle oscillazioni di Ca2+, suggerendo che un aumento primario e controllato dei livelli di ROS citosolici modificano ma non bloccano le oscillazioni di Ca2+ modulando la SERCA. I nostri dati mostrano che bassi livelli di ROS mitocondriali modulano leggermente l’omeostasi di [Ca2+]I senza interferire con la funzione mitocondriale e citosolica. Abbiamo usato quest’informazione per studiare se la sovraespressione del trasportatore di Ca2+ mitocondriale (MCU) potesse modificare la formazione di ROS mitocondriali e conseguentemente la sopravvivenza mitocondriale e cellulare dei cardiomiociti. Cellule sovraesprimenti MCU hanno mostrato un aumento nei livelli di ROS che era correlato causalmente ad un aumento della tolleranza al danno da anossia/riossigenazione (A/R) in un processo che ha coinvolto l’attivazione di AKT. Queste scoperte dimostrano che un leggero aumento della formazione di ROS mitocondriali produce un effetto protettivo. Per testare quest’ipotesi, abbiamo studiato se i ROS mitocondriali indotti da basse dosi di MitoPQ potessero diminuire la suscettibilità al danno da A/R. Non solo quest’ipotesi è stata verificata, ma anche in questo caso la protezione è stata attribuita all’attivazione di AKT. I dati di questo lavoro dimostrano che la formazione di ROS mitocondriali può innescare un ampio spettro di risposte con una chiara separazione tra livelli di ROS richiesti per evocare effetti benefici o dannosi. Cambiamenti nell’omeostasi del [Ca2+]I possono essere a monte ma anche a valle della formazione dei ROS mitocondriali e l’effetto cardioprotettivo collegato al leggero aumento dei livelli di ROS mitocondriali sembra dipendere dall’attivazione di AKT.