Contribution of Interstitial Valve Cells to Aortic Valve Calcification

Introduzione. Tradizionalmente la calcificazione valvolare aortica viene considerata un processo distrofico, ad evoluzione lenta e non modificabile. Tale visione è stata recentemente messa in discussione da evidenze che sottolineano l’importanza, nel corso della calcificazione vascolare, di un bilanciamento fra fattori promuoventi ed inibenti, nonché del ruolo svolto da processi cellulo-mediati. I lembi valvolari aortici sono popolati da cellule interstiziali valvolari (VIC) fenotipicamente eterogenee, il cui contributo specifico nel corso dei processi degenerativi della valvola è solo parzialmente conosciuto. Scopo. Scopo del presente studio è quello di ricercare e caratterizzare una sottopopolazione aortica di VIC in grado di acquisire un fenotipo pro-calcifico in seguito ad esposizione a fattori patogeni (quali endotossina [LPS] e fosfato inorganico [Pi]). Metodi e Risultati. VIC ottenute da espianti di valvole aortiche bovine (BVIC) sono state sottoposte ad un processo di clonazione, mediante tecnica di diluizione limite. I cloni di BVIC sono stati caratterizzati sotto il profilo morfologico ed immunofenotipico mediante l’utilizzo di marcatori tipici per cellule mesenchimali, cellule muscolari lisce (SMC), cellule endoteliali, cellule ematopoietiche e cellule di derivazione ossea. Fra i 40 cloni di BVIC ottenuti sono stati selezionati 4 cloni, morfologicamente rappresentativi delle diverse popolazioni isolate, che mostravano diverse caratteristiche di crescita e di profilo immunofenotipico. Sia la popolazione cellulare di VIC non clonate che i cloni non mostravano la tendenza a fenomeni spontanei di calcificazione in vitro. Le cellule sono state quindi trattate con diverse combinazioni di LPS (100 ng/ml) e Pi (2.4 mmol/L concentrazione finale) per 12 giorni. La popolazione non clonale di BVIC ha mostrato un progressivo incremento nei livelli di espressione della fosfatasi alcalina (ALP) dopo trattamento con LPS, mentre la deposizione di calcio è stata osservata solo nelle cellule trattate con la combinazione di LPS e Pi. Fra i diversi cloni solo il Clone 1 (fenotipo simil-fibroblasto) ha mostrato un significativo incremento nei livelli di espressione dell’ALP. Tale incremento si accompagnava ad un’aumentata espressione di osteocalcina (OC) e ridotto accumulo di ?-actina muscolare liscia (SMA), come documentato da studi in western blotting e citofluorimetria. Il trattamento con LPS non è stato in grado di indurre modifiche simili nel profilo fenotipico del Clone 4 (fenotipo muscolare liscio differenziato). Nonostante il significativo incremento nell’espressione di ALP ed OC, il Clone 1 non ha prodotto fenomeni di calcificazione della matrice dopo trattamento con la combinazione di LPS ed Pi. Tuttavia, aspetti di calcificazione sono stati osservati in esperimenti di co-coltura del Clone 1 e Clone 4, quando trattati con la combinazione di LPS e Pi. Inoltre, dopo semina su spugne di collagene di tipo I, il Clone 1 si è dimostrato in grado di produrre estesi fenomeni di calcificazione della matrice, in seguito a trattamento per 12 giorni con LPS e Pi. Tale combinazione ha indotto solo minimi aspetti di calcificazione nella matrice di collagene popolata dal Clone 4. Fenomeni apoptotici sono stati osservati nel Clone 1 seminato nelle spugne di collagene e trattato con LPS e Pi. Viceversa, nel caso del Clone 4 non sono stati documentati aspetti apoptotici. L’analisi proteomica della frazione citosolica del Clone 1 ha permesso di identificare 34 proteine i cui livelli di espressione si modificano con l’acquisizione del profilo pro-calcifico. Fra queste proteine è stata documentata una significativa riduzione nei livelli di molecole antiossidanti, come la superossido dismutasi [Cu-Zn] e la tioredoxina. Un significativo decremento è stato osservato anche per i livelli di dimetilarginina dimetilaminoidrolase (DDAH), un enzima intracellulare che degrada la dimetilarginina asimmetrica (ADMA) (inibitore dell’ossido nitrico sintetasi [NOS]). In linea con questi dati è stato osservato un aumento della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) da parte del Clone 1 trattato con LPS. Conclusioni. I risultati di questo lavoro dimostrano che le popolazioni clonali di BVIC sono dotate di un diverso potenziale pro-calcifico quando stimolate con uno stesso fattore patogeno. In particolare, è stata identificata una specifica sottopopolazione di BVIC, caratterizzata da un profilo fenotipico simil-fibroblasto, che si è dimostrata in grado di esprimere marcatori osteogenici e di calcificare matrice di collagene, in risposta a trattamento con endotossina ed alti livelli di fosfato inorganico.