Construction and characterization of infectious inter-genotypic Hepatitis C Virus chimeras

Il maggior ostacolo allo sviluppo di terapie anti HCV è rappresentato dalla mancanza di culture cellulari che supportano efficacemente la produzione di virus. Questo ostacolo è stato recentemente superato grazie all’isolamento di un clone, denominato JFH1 (genotipo 2a), il cui genoma porta alla produzione di particelle virali infettive sia in vitro che in vivo. Anche se tale sistema cellulare (HCVcc) rappresenta un’importante conquista, presenta il grosso limite della dipendenza dal subtipo JFH1 e da una chimera intra-genotipica in cui la regione strutturale deriva dal subtipo J6, comunque di genotipo 2a. Per effettuare studi comparativi su diversi genotipi, sono stati quindi ingegnerizzati virus chimerici inter-genotipici in cui la prima metà del genoma di JFH1 (dal 5’- UTR alla proteina NS2) è stata sostituita con l’analoga regione proveniente da altri genotipi. Nel presente lavoro sono state costruite due chimere inter-genotipiche con una nuova strategia. A differenza delle precedenti, la regione strutturale è stata mantenuta interamente di JFH1, ad eccezione della porzione solubile (ectodominio) di una o entrambe le proteine dell’envelope E1 e E2. In questo modo è stato possibile analizzare il ruolo di tale regione, ed in particolare dell’ectodominio di E2, nella produzione di particelle infettive di HCV. I risultati riportati dimostrano per la prima volta che proteine dell’envelope derivanti da genotipi diversi (nello specifico E1 di genotipo 2a ed E2 di genotipo 1b) possono correttamente interagire a formare dimeri E1E2, rappresentanti la forma funzionale delle proteine dell’envelope. Ciononostante nessuno dei due costrutti chimerici prodotti ha portato all’ottenimento di particelle virali infettive, indicando la presenza di determinanti all’interno della porzione sostituita importanti per la produzione di HCV. In particolare, grazie ad esperimenti di microscopia confocale, analisi della presenza di precursori virali all’interno delle cellule trasfettate ed esperimenti di trans-complementazione, per la prima volta dimostriamo che la regione ectodominica della proteina dell’envelope E2 è fortemente implicata nell’assemblaggio di nuovi virioni, probabilmente attraverso interazioni genotipo-specifiche con altre proteine strutturali. Di conseguenza, nel nostro sistema, la produzione di particelle virali risulta drasticamente alterata a causa dell’incompatibilità genetica tra il backbone JFH1 e la porzione ectodominica di E2 derivante da genotipo 1b. Dato che recentemente è stato riportato un ruolo chiave per NS2 nel processo di assemblaggio, la nostra ipotesi è che una delle interazioni genotipo-specifiche richieste coinvolga per l’appunto E2 nella sua regione solubile e la proteina non strutturale NS2. Quest’ipotesi rimane comunque da approfondire con ulteriori esperimenti atti a meglio definire il tipo di relazione tra proteine virali e il ruolo di tali interazioni nell’assemblaggio di nuovi virioni.